Isolamento de células-tronco a partir de culturas esferóides tridimensionais
Summary
Usando células epitelia de próstata primárias humanas, relatamos um novo método livre de biomarcadores de caracterização funcional de células semelhantes a troncos por um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides. Um protocolo passo a passo é descrito para a rotulagem de células BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formação tridimensional de esferóides; identificação de células-tronco de retenção de rótulos por imunocitoquímica; e isolamento pela FACS.
Abstract
Apesar dos avanços na pesquisa de células-tronco adultas, a identificação e o isolamento das células-tronco de espécimes de tecidos continua sendo um grande desafio. Enquanto as células-tronco residentes são relativamente quiescentes com restrições de nicho em tecidos adultos, elas entram no ciclo celular na cultura tridimensional (3D) livre de âncoras e passam por divisão de células simétricas e assimétricas, dando origem a tronco e progenitor Células. Este último proliferar rapidamente e são a população celular principal em vários estágios do compromisso de linhagem, formando esferóides heterogêneos. Usando células epiteliais de próstata humanas normais primárias (HPrEC), foi desenvolvido um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides que permite a identificação e o isolamento funcional das células-tronco que iniciam esferóides em uma única resolução celular.
HPrEC ou linhas celulares são bidimensionalmente (2D) cultivadas com BrdU por 10 dias para permitir sua incorporação no DNA de todas as células divisórias, incluindo células-tronco auto-renovadoras. Lavar começa após a transferência para a cultura 3D por 5 dias, durante os quais as células-tronco se auto-renovam através da divisão assimétrica e iniciam a formação esferóide. Enquanto as células-tronco filhas relativamente quiescentes retêm o DNA parental com rótulo BrdU, os progenitores da filha proliferam rapidamente, perdendo o rótulo BrdU. A BrdU pode ser substituída por CFSE ou Far Red pró-corantes, que permitem o isolamento de células-tronco vivas pela FACS. As características das células-tronco são confirmadas pela formação esferóide in vitro, ensaios de regeneração de tecidos invivo e documentando suas divisões de células simétricas/assimétricas. As células-tronco isoladas que retêm rótulos podem ser rigorosamente interrogadas por estudos moleculares e biológicos a jusante, incluindo RNA-seq, ChIP-seq, captura de células únicas, atividade metabólica, perfil proteoma, imunocitoquímica, formação organóide e regeneração in vivo do tecido. Importante, esta abordagem de isolamento de células-tronco funcionais sem marcadores identifica células-tronco de espécimes de câncer fresco e linhas de células cancerosas de vários órgãos, sugerindo ampla aplicabilidade. Ele pode ser usado para identificar o câncer de células-tronco biomarcadores, tela farmacêutica visando células-tronco de câncer, e descobrir novos alvos terapêuticos em cânceres.
Introduction
A próstata humana contém epitélio luminal com função de secretismo e células basais subjacentes, juntamente com um componente de célula neuroendócrina incomum. As células epiteliais, neste caso, são geradas a partir de uma população rara de células-tronco da próstata que são relativamente quiescentes in vivo e atuam como um sistema de reparo para manter a homeostase glandular ao longo da vida1. Apesar de muitos avanços, a identificação e isolamento funcional das células-tronco da próstata continua a ser um grande desafio no campo. Biomarcadores de células-tronco, incluindo metodologias baseadas em marcadores de superfície celular combinadas com citometria de fluxo são comumente usados para pesquisa de células-tronco2,3,4. No entanto, os resultados para enriquecimento e isolamento variam muito em função de combinações de marcadores e especificidade de anticorpos5,6,levantando questões sobre a identidade das células isoladas. Outra abordagem amplamente utilizada para o enriquecimento de células semelhantes a troncos é a cultura esferóide tridimensional (3D)2,3,4. Enquanto as células-tronco residentes são relativamente quiescentin vivo com restrições de nicho, elas passam por divisão celular na cultura da matriz 3D (simétrica e assimétrica), gerando células-tronco e progenitoras que se reproduzem rapidamente em direção ao compromisso de linhagem7,8. Os esferóides formados são uma mistura heterogênea contendo células-tronco e células progenitoras em vários estágios do compromisso de linhagem, incluindo células progenitoras em estágio inicial e tardio. Assim, os ensaios que utilizam todo o esferóides não são exclusivos de células-tronco, tornando a identificação de propriedades únicas de células-tronco inconclusivas. Portanto, é fundamental criar ensaios para identificar e separar as células-tronco da próstata de seus progenitores filhas. Para este fim, o objetivo do protocolo atual é estabelecer um sistema de ensaio que permita a identificação eficiente e isolamento das células-tronco dos tecidos da próstata humana seguido por uma análise robusta a jusante de suas funções biológicas.
A retenção de rótulos de 5 bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) a longo prazo é amplamente utilizada para o rastreamento de linhagem in vivo e in vitro de células-tronco com base em seu tempo de duplicação prolongada9,10. A abordagem atual para a identificação e isolamento de células-tronco da próstata descritas aqui é baseada em sua característica quiescente relativa e propriedades de retenção de rótulos dentro de uma população epiteliana mista. Além disso, com base na hipótese imortal do DNA da cadeia, apenas as células-tronco podem ser submetidas a divisão de células assimétricas. A célula-tronco representa a célula filha que contém o DNA parental mais velho, enquanto a célula progenitora, que é uma célula filha comprometida, recebe o DNA recém-sintetizado. A propriedade única de células-tronco descrita acima é explorada para realizar rotulagem BrdU em células-tronco parentais em culturas primárias e, em seguida, acompanhar seu rótulo após BrdU-washout após a transferência para a cultura esferóide sem âncora 3D. Enquanto a maioria das células epiteliais da próstata primária retém um fenótipo basal e de trânsito amplificando na cultura 2D, há também uma população rara de células-tronco multipotentes reabastecendo e mantendo a homeostase epitelial como evidenciado pela formação de esferóides ou organóides totalmente diferenciados com a mídia cultura correspondente após a transferência para sistemas 3D3,12. Em nosso protocolo atual, usando esféóides de próstata HPrEC ou BrdU à base de prostasphere, CFSE ou ensaios de retenção de far red seguidos de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), identificamos células-tronco de retenção de rótulos em esferóides em um nível de célula única13.
Importante, confirmamos ainda mais as características das células-tronco das células de retenção de rótulos dentro de esferóides em estágio inicial em comparação com as células progenitoras com compromisso de linhagem. Estes incluem divisão assimétrica de células-tronco, capacidade de formação esferóide in vitro e capacidade de regeneração do tecido invivo, atividade de autofagia elevada, biogênese ribossoma aumentada e diminuição da atividade metabólica. Posteriormente, foi realizada a análise do RNAseq. Genes diferencialmente expressos em células esferóides de retenção de rótulos foram observados que podem servir como novos biomarcadores para células-tronco da próstata humana. Esta abordagem de retenção de rótulos à base de esferóide pode aplicar-se a espécimes de câncer para identificar de forma semelhante um pequeno número de células semelhantes a troncos de câncer, proporcionando assim oportunidades translacionais para gerenciar as populações resistentes terapêuticas13. Apresentado abaixo está o ensaio de retenção de rótulos baseado em prostasphere usando células epiteliais primárias da próstata humana (HPrEC) como exemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O fluxo de citometria usando vários marcadores de superfície de células-tronco é uma abordagem comumente usada para pesquisa com células-tronco, apesar de não ter especificidade e seletividade1,5,6. Enquanto a formação esferóide em um sistema de cultura 3D é outro método útil para enriquecer a população de células-tronco raras de células epiteliais primárias, incluindo HPrEC, os esferóides resultantes ainda sã…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por subvenções do Instituto Nacional do Câncer R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Agradecemos ao Núcleo de Citometria Flow da Universidade de Illinois, em Chicago, pela assistência na triagem celular.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Recherche en cancérologie. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Recherche en cancérologie. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
