Ved hjelp av humant primære prostata epitelceller, rapporterer vi en roman biomarkør-fri metode for funksjonell karakterisering av stilk-lignende celler ved en spheroid-basert etikett-oppbevaring analysen. En trinnvis protokoll er beskrevet for BrdU, CFSE eller far Red 2D cellemerking; tredimensjonal spheroid formasjon; Label-beholder stilk-lignende celle identifisering av immuncytokjemi; og isolert av FACS.
Til tross for fremskritt i voksen stamcelleforskningen, er identifisering og isolering av stamceller fra vevsprøver fortsatt en stor utfordring. Mens bosatt stamceller er relativt Quiescent med nisje begrensninger i voksen vev, de kommer inn i cellen syklus i anker-fri tredimensjonal (3D) kultur og gjennomgår både symmetrisk og asymmetrisk celledeling, noe som gir opphav til både stilk og stamfar Celler. Sistnevnte sprer raskt og er den store cellen befolkning på ulike stadier av avstamning forpliktelse, danner heterogene spheroids. Ved hjelp av primære normal humant prostata epitelceller (HPrEC), en spheroid-basert, etikett-oppbevaring analysen ble utviklet som tillater identifisering og funksjonell isolering av spheroid-initiering stamceller på en enkelt celle oppløsning.
HPrEC eller cellelinjer er to-tredimensjonalt (2D) kultivert med BrdU i 10 dager for å tillate sin innlemmelse i DNA av alle dele celler, inkludert selv fornyelse stamceller. Vask ut starter ved overføring til 3D-kulturen i 5 dager, der stamceller selv fornye gjennom asymmetrisk divisjon og initiere spheroid formasjon. Mens relativt Quiescent datter stamceller beholde BrdU-merket foreldrenes DNA, datteren forfedre raskt sprer, mister BrdU etiketten. BrdU kan erstattes med CFSE eller far Red Pro-fargestoffer, som tillater levende stilk cellen isolasjon av FACS. Stem celle egenskaper bekreftes av in vitro spheroid formasjon, in vivo vev regenerering analyser, og ved å dokumentere deres symmetrisk/asymmetrisk celle divisjoner. Den isolerte etikett-beholde stamceller kan bli grundig avhørt av nedstrøms molekylære og biologiske studier, inkludert RNA-SEQ, ChIP-SEQ, enkelt celle fangst, metabolsk aktivitet, proteom profilering, immuncytokjemi, organoid formasjon, og in vivo vev gjenfødelse. Viktigere, identifiserer denne markøren-fri funksjonell stilk cellen isolasjon tilnærming stilk-lignende celler fra fersk kreft prøver og kreftcelle linjer fra flere organer, noe som tyder på bred relevans. Den kan brukes til å identifisere kreft stilk-lignende celle biomarkører, skjermen legemidler rettet mot kreft stilk-lignende celler, og oppdage romanen terapeutiske mål i kreft.
Den menneskelige prostatakjertel inneholder luminal epitel med sekretoriske funksjon og basal celler underliggende det sammen med en uvanlig Nevroendokrine celle komponent. Epitelceller, i dette tilfellet, er generert fra en sjelden populasjon av prostata stamceller som er relativt Quiescent in vivo og fungere som et reparasjonssystem for å opprettholde kjertel homeostase gjennom hele livet1. Til tross for mange fremskritt, er identifisering og funksjonell isolering av prostata stamceller fortsatt en stor utfordring i feltet. Stem Cell biomarkører, inkludert Cell Surface markør-baserte metoder kombinert med Flow flowcytometri brukes vanligvis for stilk cellen forskning2,3,4. Men resultatene for berikelse og isolasjon varierer mye som en funksjon av markør kombinasjoner og antistoff spesifisitet5,6, heve spørsmål om identiteten til de isolerte cellene. En annen mye brukt tilnærming for Stem-lignende celle berikelse er tredimensjonal (3D) spheroid kultur2,3,4. Mens Resident stamceller er relativt Quiescent in vivo med nisje begrensninger, de gjennomgår celledeling i 3D Matrix kultur (både symmetrisk og asymmetrisk), genererer både stilk og stamceller som raskt reprodusere mot avstamning engasjement7,8. Dannet spheroids er en heterogen blanding som inneholder både stamceller og stamceller på ulike stadier av avstamning forpliktelse, inkludert tidlig og sent stadium stamceller. Dermed analyser ved hjelp av hele spheroids er ikke Stamcelle eksklusive, noe som gjør identifisering av unike stilk cellen egenskaper mangelfulle. Derfor er det avgjørende å lage analyser for å identifisere og skille prostata stamceller fra deres datter forfedre. Mot dette formålet, er målet med den nåværende protokollen for å etablere en analysesystem som gjør det mulig for effektiv identifisering og isolering av stamceller fra humant prostata vev etterfulgt av robust nedstrøms analyse av deres biologiske funksjoner.
Langsiktig 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) Label-oppbevaring er mye brukt for in vivo og in vitro avstamning tracing av stamceller basert på deres forlenget dobling tid9,10. Den nåværende tilnærmingen for prostata stilk cellen identifisering og isolasjon beskrevet her er basert på deres relative Quiescent karakteristiske og etikett-oppbevaring egenskaper innenfor en blandet epitel befolkning. Videre, basert på den udødelige Strand DNA-hypotesen, kan bare stamceller gjennomgå asymmetrisk celledeling. Stam cellen representerer datter cellen som inneholder det eldre foreldrenes DNA, mens Stam cellen, som er en engasjert datter celle, mottar det nylig syntetisert DNA. Den unike stilk cellen eiendom beskrevet ovenfor er utnyttet til å utføre BrdU merking i foreldrenes stamceller i primære kulturer og deretter spore sin etikett etter BrdU-bleke ved overføring til 3D-anker-fri spheroid kultur. Mens flertallet av primær prostata epitelceller beholde en basal og transitt forsterke fenotype i 2D kultur, er det også en sjelden befolkning på Multipotent stamceller fylle og vedlikeholde epitel homeostase som dokumentert ved dannelse av spheroids eller fullt differensiert organoids med tilsvarende kultur Media ved overføring til 3D-systemer3,12. I vår nåværende protokoll, ved hjelp av HPrEC prostata spheroids eller prostasphere-baserte BrdU, CFSE, eller far Red oppbevaring analyser etterfulgt av fluorescens aktivert celle sortering (FACS), identifiserer vi etikett-beholder stamceller i spheroids på en enkelt cellenivå13.
Viktigere, vi bekreftet ytterligere Stamcelle egenskapene til etikett-beholde celler innen tidlig stadium spheroids i forhold til stamceller med avstamning forpliktelse. Disse inkluderer stilk cellen asymmetrisk divisjon, in vitro spheroid dannelse evne og in vivo vev gjenfødelse kapasitet, forhøyet autofagi aktivitet, utvidet ribosom kognitiv og redusert metabolsk aktivitet. Deretter ble RNAseq-analysen utført. Differensielt uttrykte gener i etikett-beholder spheroid celler ble observert som kan tjene som romanen biomarkører for humant prostata stamceller. Dette spheroid-basert etikett-beholder tilnærming kan gjelde for kreft prøver å tilsvarende identifisere et lite antall kreft stilk-lignende celler, og dermed gi translational muligheter til å håndtere den terapeutiske resistente populasjoner13. Presentert nedenfor er prostasphere-baserte Label-oppbevaring analysen bruker menneskelige primære prostata epitelceller (HPrEC) som et eksempel.
Flow flowcytometri bruker flere Stem Cell Surface markører er en vanlig metode for stamcelleforskningen tross mangler både spesifisitet og selektivitet1,5,6. Mens spheroid formasjon i et 3D kultur system er en annen nyttig metode i berikende den sjeldne stilk cellen befolkning fra primære epitelceller, inkludert HPrEC, den resulterende spheroids er fortsatt en heterogen blanding av stammen og stamceller2</su…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Vi takker Flow flowcytometri Core ved University of Illinois i Chicago for assistanse på celle sortering.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
2N HCl | |||
35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated, ![]() |
40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
6-well culture plates | Corning | 353046 | |
8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
ice bucket and ice | |||
Inverted microsope with digital camera | |||
Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
Methanol | Corning | A452-4 | |
Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Pipettors and tips, various sizes | |||
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
Serological pipets, various sizes | |||
Software for sphere counting and size measurements | |||
Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Water bath, 37 °C | |||
z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |