Vi presenterer et microinjectrode system designet for elektrofysiologi og assistert levering av eksperimentelle sonder (dvs. nanosensors, microelectrodes), med valgfri legemiddel infusjon. Allment tilgjengelige mikrovæskebasert komponenter er koplet til en kanyle som inneholder sonden. En trinnvis protokoll for microinjectrode konstruksjon er inkludert, med resultater under muscimol infusjon i macaque cortex.
Dette microinjectrode systemet er designet for legemiddel infusjon, elektrofysiologi, og levering og gjenfinning av eksperimentelle sonder, slik som microelectrodes og nanosensors, optimalisert for gjentatt bruk i våken, oppfører dyr. Microinjectrode systemet kan konfigureres for flere formål: (1) enkel ordning av kanyle for plassering av en eksperimentell sonde som ellers ville være for skjøre til å trenge inn i Dura mater, (2) mikrovæskebasert infusjon av et medikament, enten uavhengig eller koplet til en kanyle som inneholder en eksperimentell sonde (dvs. microelectrode, nanosensor). I denne protokollen forklarer vi trinnvis byggingen av microinjectrode, dens kopling til mikrovæskebasert komponenter, og protokollen for bruk av systemet in vivo. De mikrovæskebasert komponentene i dette systemet gir mulighet for levering av volumer på nanoliter skala, med minimal gjennomtrengning skade. Drug infusjon kan utføres uavhengig eller samtidig med eksperimentelle sonder som microelectrodes eller nanosensors i en våken, oppfører seg dyr. Anvendelser av dette systemet spenner fra å måle virkningene av et medikament på kortikale elektrisk aktivitet og atferd, å forstå funksjonen av en bestemt region av cortex i sammenheng med atferdsdata ytelse basert på sonde eller nanosensor målinger. For å demonstrere noen av egenskapene til dette systemet, presenterer vi et eksempel på muscimol infusjon for reversibel deaktivering av frontal øye feltet (FEF) i rhesus macaque under en arbeidsminne oppgave.
Elektrofysiologi og injeksjons metoder er mye brukt i nevrovitenskap for å studere neuronal aktivitet og adferd, in vivo, i gnagere og primater. I løpet av de siste tre ti årene, forbedringer av de tidlige injectrode modellene tillot en mer presis og mindre invasiv teknikk, og samtidig opptak og narkotika injeksjon på bestemte Brain sites1,2,3. For primater spesielt, evnen til å presist levere små volumer med minimal vevsskade er kritisk hvis teknikken skal brukes til studiet av avanserte kognitive funksjoner som krever høyt utdannede dyr. Nylige fremskritt inkluderer kroniske elektrofysiologisk og kjemiske målinger i kombinasjon med stimulering ved bruk av implantert sonder4, og kombinert opptak og mikrovæskebasert av narkotika har nylig blitt testet i gnagere5. Injectrode-systemet som beskrives her, tillater elektrofysiologisk innspilling, stimulering og presis legemiddellevering, og det har allerede blitt implementert i flere primater Labs6,7,8.
Den økende tilgjengeligheten av delikate, spesialiserte sensorer, sliksom nanosensors med nevrovitenskap programmer, krever en pålitelig metode for å få sonden gjennom Dura mater uten å skade den skjøre nanoskala enheter eller microelectrode tips.
Vi utformet et microinjectrode system som overvinner de tekniske utfordringene ved å kombinere disse metodene ved hjelp av lett tilgjengelige, rimelige komponenter, og forenkler to hovedfunksjoner: (i) muligheten til å plassere en skjør eksperimentell sonde, for eksempel en microelectrode eller nanosensor, gjennom Dura mater og nevrale vev, beskyttet mot eventuelle skader. Denne funksjonaliteten tillater plassering av eksperimentell sonde på målrettede steder, levert ved hjelp av kanyle som en guide gjennom nevrale vev. (II) muligheten til å bruke en microelectrode til å utføre eksperimenter som kombinerer elektrofysiologi opptak og elektrisk stimulering med injeksjonsbruk.
Systemet vårt bruker en guide tube til å trenge inn Dura, sammen med en kanyle som fungerer både for narkotika levering (når du bruker systemet for microinfusion) og gir ekstra beskyttelse for microelectrode eller nanosensor (både når passerer gjennom Dura og nevrale vev). Dette systemet kan enkelt bygges med mye kommersielt tilgjengelige komponenter, som er billig og lett å finne. Vi minimerer gjennomtrengning skade ved hjelp av en liten diameter kanyle (ytre diameter OD = 235 μm, indre diameter ID = 108 μm).
Her presenterer vi steg-for-steg instruksjoner for microinjectrode konstruksjon og konfigurering av mikrovæskebasert systemet. Vi forklarer trinnene som er nødvendige for bruk av microinjectrode, enten uavhengig eller koblet til mikrovæskebasert systemet for injeksjonsvæsker. En lignende tilnærming kan påføres med alle skjøre eksperimentelle sonde, for eksempel en nanosensor9,10. Sonden kan front-eller back-lastet inn i kanyle (avhengig av design), og vil være beskyttet mot skade når du penetrerer Dura og nevrale vev. Vi gir eksempel data fra en in vivo eksperiment med ikke-menneskelige primater, der vi brukte en tungsten microelectrode å utføre elektrisk stimulering, og senere injisert muscimol i frontal øyet feltet (FEF) mens dyret utførte et minne guidet saccade (MGS) oppgave.
Flere metoder er tilgjengelig for å utføre samtidige levering av legemidler og elektrofysiologi. Vårt system er ment å ha fleksibiliteten til å bli brukt til opptak enten uavhengig eller i kombinasjon med sprøytebruk, og å ha muligheten til å presist plassere noen skjøre eksperimentell sonde, for eksempel en nanosensor eller en microelectrode, beskyttet mot eventuelle skader, gjennom Dura mater og nevrale vev. Systemet gir presis kontroll over legemiddel infusjons volumer med det blotte øye (17 nL presisjon vist i tidligere studier i vår Lab3).
Det er flere spesialiserte systemer for Trykk injeksjon med mindre diameter12. Disse systemene tillater flere opptaks steder, men det komplekse oppsettet av programvare og maskinvare som kreves for kontroll av systemet, medfører høyere kostnader for hver av komponentene, og har mindre fleksibilitet til å samhandle med eksperimentelle sonder som ennå ikke er kommersialisert i stor skala. Videre krever ikke vår injectrode en kronisk implantat og gir en stor grad av fleksibilitet: kompatibel med biosensors å måle kjemiske og elektrofysiologisk signaler, og i stand til infusjonen narkotika også, med potensial til å måle effekten av lokaliserte legemiddel infusjoner på disse svarene.
Utformingen gjør at eksperimentell sonde skal stakk etter Dura penetrasjon for å unngå skade på strukturen i sonden. Denne ansiktstrekk innrømmer for det multifunksjonalitet av apparatet, å trenge gjennom det Dura uten risk skade av alle eksperimentelle sonde som nanometer-skalaen nanosensors10. Men det er en begrensning av lengden som kan være stakk, begrenset av antall svinger av dobbsko, begrenset til ~ 1 mm for standard ferrules. Det er minimal vevsskade på grunn av den lille kanyle diameter (228 μm).
I eksperimentet viste vi, systemet ble brukt til å utføre kontrollert levering av muscimol for reversibel deaktivering av FEF, samtidig med enten elektrisk stimulering eller ekstracellulære opptak (enkelt Nevron, lokale feltet potensial) ved hjelp av en microelectrode. Dette eksperimentet i FEF krever microstimulation av FEF å bekrefte saccade vektorer før inaktive, og stoffet ble tilført for å studere arbeidshukommelsen under reversibel FEF inaktive. Det er usannsynlig at et opptak fra samme isolerte enkelt Nevron kan opprettholdes før og etter injeksjon av narkotika; men vi var i stand til å registrere lokale feltet potensialer før og etter infusjon. Her viser vi et eksperiment som kombinerer injeksjon, opptak og elektrisk stimulering.
Når den er satt opp, er metoden svært pålitelig og robust. Men på grunn av utfelling av små molekyler (f. eks, salt) i den lille rør og porter, en grundig rødme er nødvendig etter hvert eksperiment for å holde materialer fri for hindringer og lekkasjer. På grunn av enkelheten i hele kretsen, kan hver komponent byttes ut uavhengig for enkel feilsøking.
Selv om metoden ble demonstrert i FEF området i et ikke-menneskelige primater, kan prinsippet brukes til andre hjerne området der en kombinasjon av elektrisk stimulering, opptak, og sprøytebruk er ønsket, i arter av gnager størrelse eller større.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Institutes of Health (NIH), tilskudd EY026924 og EY014800 (til B.N.), en ubegrenset Grant fra forskning for å hindre blindhet, Inc., New York, NY til Institutt for Oftalmologi og Visual Sciences, University av Utah, og oppstart midler gitt til re av Henry Samueli School of Engineering og Institutt for elektroteknikk ved University of California, Irvine. Denne metoden er basert på en tidligere rapport om en lignende metode utviklet i Dr. Tirin Moore ‘ s Lab, publisert i Noudoost & Moore 2011, Journal of nevrovitenskap metoder. Forfatterne takker Dr. Kelsey Clark for hennes kommentarer på manuskriptet.
3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf |
Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
Custom adapter | Custom provider | – | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf |
Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
Sterile saline (sodium chloride) 0.9%. | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |