从患者前列腺癌骨转移标本及其异种移植物中提取的三维（3D）有机物的建立与分析
Summary
患者BMPC标本和骨转移性前列腺癌异种移植物的三维培养，保持其原始肿瘤的功能异质性，导致囊肿、球形和复杂的肿瘤状有机体。本手稿为异质患者衍生样本的 3D 培养及其使用 IFC 进行分析提供了优化策略和方案。
Abstract
人类患者肿瘤标本的三维（3D）培养和前列腺癌患者衍生异种移植（PDX）模型，称为患者衍生器官（PDO），是研究前列腺癌的肿瘤发生和转移。它们的主要优点是，与不传统的细胞系相比，它们保持了原始组织独特的基因组和功能异质性。此外，PDO的3D培养物可用于预测药物治疗对个别患者的影响，是向个性化医学迈出的一步。尽管有这些优点，但少数组通常使用此方法，部分原因是 PDO 培养条件的广泛优化，这可能需要不同的患者样本。我们之前已经证明，我们的前列腺癌骨转移PDX模型，PCSD1，重述了供体患者的骨转移对抗雄激素治疗的抵抗力。我们使用 PCSD1 3D 有机体进一步描述抗雄激素抵抗机制。在概述当前发布的 PDX 和 PDO 模型研究之后，我们描述了在优化培养条件下使用圆顶或浮动基底膜（例如 Matrigel）球体（例如 Matrigel）的 PDO 3D 培养的分步协议。介绍了本体缝合成像和细胞处理，用于本体。该协议可进一步针对其他应用进行优化，包括西印、共培养等，并可用于探索与耐药性、肿瘤发生、转移和治疗相关的3D培养PDO特性。
Introduction
三维培养的有机物已经引起注意，因为他们有潜力重述其原始组织1，2，3，4，5的体内结构，细胞功能和遗传特征。最重要的是，从患者肿瘤组织或患者衍生异种移植（PDX）模型建立的3D类有机体提供了宝贵的机会，以了解细胞信号机制对肿瘤发生，并确定药物治疗对每个细胞群的影响，每个细胞群6，7，8，9，10，11，12，13。Drost等人为建立人类和小鼠前列腺器官制定了标准规程，在泌尿学领域得到了广泛的应用。此外，已作出重大努力，以进一步表征3D有机体，并了解肿瘤发生和转移4，12，14，15的详细机制。除了以前为 3D 有机体培养建立且被广泛接受的协议之外，我们在这里还介绍了 PDO 的 3D 区域性的分步协议，在优化的培养条件下使用三种不同的点胶方法。
在这份手稿中，3D有机体被确立为骨转移性前列腺癌（BMPC）的体外模型。用于这些培养的细胞来自前列腺癌圣地亚哥（PCSD）系列，直接来自患者前列腺癌骨转移肿瘤组织（PCSD18和PCSD22）或患者衍生异种移植（PDX）肿瘤模型（样本命名为PCSD1、PCSD13和PCSD17）。由于前列腺癌细胞的自发性骨转移在基因工程小鼠模型16中很少见，我们利用直接将人类肿瘤细胞注射到雄性Rag2-/—-/-小鼠中建立了骨转移性前列腺癌的PDX模型17。
一旦从异质患者肿瘤细胞或患者衍生的异种移植物中建立3D有机体，确认其作为前列腺肿瘤细胞的身份并确定其在3D器官培养物中的表型至关重要。免疫荧光化学（IFC）允许在每个细胞中原位显示蛋白质表达，通常指示特定细胞群2、4的潜在功能。一般来说，包括组织和细胞在内的绝大多数样品的IFC协议是简单明了的，并且完全优化。然而，细胞密度和器官的数量可以明显低于传统培养物。因此，国际有机物的国际金融委员会协议要求采取额外步骤，以确保样品中所有有机物的正确处理和嵌入石蜡。我们描述了腺苷预嵌入工艺的其他步骤，并介绍了在幻灯片上标记切片有机体的位置的提示，提高了IFC在有机物上的成功率，特别是当有机体样本的细胞密度低于预期时。
Protocol
Representative Results
Discussion
从患者骨转移性前列腺癌细胞中提取的3D器官仍然相对少见。在这里，我们描述了成功建立BMPC串行3D患者衍生器官（PDO）的策略和进一步优化的协议。此外，还描述了用于保护具有较低细胞密度的样品中的有机物的协议，用于IFC和IHC分析。囊肿、球形和更复杂的有机体形式的差分表型表明，该协议提供了培养条件，允许患者的异体肿瘤细胞群保持其细胞表型和结构。因此，本文描述的培养条件，?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了利奥和安妮·阿尔伯特慈善基金会和JM基金会的支持。我们感谢加州大学圣地亚哥摩尔斯癌症中心的成员，杨静博士和杨凯博士允许我们使用他们的微体和兰德尔法语，外科系的技术专长。
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
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