Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos
Summary
Culturas tridimensionais de amostras de BMPC pacientes e xenoenxertos de câncer de próstata metastático mantêm a heterogeneidade funcional de seus tumores originais resultando em cistos, esferoides e organoides complexos, semelhantes a tumores. Este manuscrito fornece uma estratégia de otimização e protocolo para a cultura 3D de amostras derivadas de pacientes heterogêneos e sua análise utilizando IFC.
Abstract
Cultura tridimensional (3D) de organoides de tumores de pacientes humanos e modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) de câncer de próstata, referidos como organoides derivados do paciente (PDO), são um recurso inestimável para estudar o mecanismo de câncer de próstata tumorigênese e metástase do câncer de próstata. Sua principal vantagem é que eles mantêm a heterogeneidade genômica e funcional distinta do tecido original em comparação com as linhas celulares convencionais que não. Além disso, culturas 3D de PDO podem ser usadas para prever os efeitos do tratamento medicamentoso em pacientes individuais e são um passo para a medicina personalizada. Apesar dessas vantagens, poucos grupos utilizam rotineiramente esse método em parte devido à ampla otimização das condições culturais pdo que podem ser necessárias para diferentes amostras de pacientes. Demonstramos anteriormente que nosso modelo de Metástase Óssea do câncer de próstata PDX, PCSD1, recapitulou a resistência da metástase óssea do paciente doador à terapia antiandgênica. Usamos organoides PCSD1 3D para caracterizar mais os mecanismos de resistência antiandrogênica. Seguindo uma visão geral dos estudos publicados atualmente dos modelos PDX e PDO, descrevemos um protocolo passo a passo para a cultura 3D de PDO usando esferas de membrana de porão de domed ou flutuante (por exemplo, Matrigel) em condições de cultura otimizadas. Também são descritas imagens de pontos vivos e processamento celular para histologia. Este protocolo pode ser ainda mais otimizado para outras aplicações, incluindo mancha ocidental, co-cultura, etc. e pode ser usado para explorar características do PDO cultivado cultivado em 3D relativos à resistência a medicamentos, tumorigênese, metástase e terapêutica.
Introduction
Organoides culturais tridimensionais têm chamado a atenção por seu potencial de recapitular a arquitetura in vivo, funcionalidade celular e assinatura genética de seus tecidos originais1,2,3,4,5. Mais importante, organoides 3D estabelecidos a partir de tecidos tumorais pacientes ou modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) oferecem oportunidades inestimáveis para entender mecanismos de sinalização celular sobre tumorigênese e determinar os efeitos do tratamento medicamentoso em cada população celular6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 desenvolveram um protocolo padrão para o estabelecimento de organoides de próstata humano e rato, que tem sido amplamente adotado no campo da urologia. Além disso, foram dedicados esforços significativos para maior caracterização de organoides 3D e para compreender os mecanismos detalhados de tumorigênese e metástase4,12,14,15. Além do protocolo previamente estabelecido e amplamente aceito para culturas de organoides 3D, descrevemos aqui um protocolo passo a passo para a cultura 3D do PDO usando três métodos de doming diferentes em condições culturais otimizadas.
Neste manuscrito, os organoides 3D foram estabelecidos como um modelo ex vivo de câncer de próstata metastático ósseo (BMPC). As células utilizadas para essas culturas vieram da série DeSone câncer de próstata San Diego (PCSD) e foram derivadas diretamente de tecidos tumores metastáticos do câncer de próstata paciente (PCSD18 e PCSD22) ou modelos de tumor derivados do paciente (PDX) (amostras chamadas PCSD1, PCSD13 e PCSD17). Como a metástase óssea espontânea das células cancerígenas da próstata é rara nos modelos de camundongos geneticamente modificados16,usamos injeção intra-femoral direta (IF) de células tumorais humanas em rag2 masculino-/-γc-/- camundongos para estabelecer os modelos PDX de câncer de próstata metastáticoósseo 17.
Uma vez que os organoides 3D são estabelecidos a partir de células tumorais heterogêneas ou xenoenxertos derivados do paciente, é essencial confirmar sua identidade como células tumorais de próstata e determinar seus fenótipos nas culturas organoides 3D. A química da imunofluorescência (IFC) permite a visualização da expressão proteica in situ em cada célula, muitas vezes indicando as funções potenciais para populações específicas de células2,4. Em geral, os protocolos IFC para uma grande maioria das amostras, incluindo tecidos e células, são simples e totalmente otimizados. No entanto, a densidade celular e o número de organoides podem ser significativamente menores do que o da cultura convencional. Portanto, o protocolo IFC para organoides requer etapas adicionais para garantir o processamento adequado e incorporação em parafina para todos os organoides nas amostras. Descrevemos etapas adicionais para um processo de preincorporação de agarose e dicas para rotular a localização de organoides seccionados no slide que aumenta a taxa de sucesso do IFC em organoides especialmente quando as amostras de organoides têm menor densidade celular do que o desejado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoides 3D derivados da metástase óssea paciente células cancerígenas de próstata ainda são relativamente raras. Aqui, descrevemos estratégias e protocolo otimizado para obter organoides derivados de pacientes 3D (PDOs) de BMPC. Além disso, são descritos protocolos para proteger os organoides em amostras com menor densidade celular para análise ifc e IHC. Fenótipos diferenciais na forma de cisto, esferoides e organoides mais complexos indicam que esse protocolo fornece condições culturais que permitem que…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo contou com o apoio da Fundação de Caridade Leo e Anne Albert e da Fundação JM. Agradecemos aos membros do Centro de Câncer da Universidade da Califórnia de San Diego Moores, Dr. Jing Yang e Dr. Kay T. Yeung por nos permitirem o uso de seu microtome e Randall French, Departamento de Cirurgia para perícia técnica.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- . Keyence Fluorescence Microscope Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019)
