Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi
Summary
Bu protokolün amacı, DNA origami nanoyapılar üzerinde moleküler motor toplulukları oluşturmak ve toplam iç yansıma floresan mikroskopisi kullanarak topluluk hareketliliğini gözlemlemektir.
Abstract
Sitoskelet motorları ökaryotik hücrelerde mitoz, kargo taşımacılığı, hücresel hareketlilik ve diğerleri dahil olmak üzere çok çeşitli fonksiyonlardan sorumludur. Bu işlevlerin çoğu, motorların topluluklar halinde çalışmasını gerektirir. Bireysel sitoskeletel motorların mekanizmaları hakkında bilgi zenginliğine rağmen, motor topluluklarının mekanizmaları ve ortaya çıkan davranışları hakkında nispeten daha az bilgi sahibi dir. motor numarasını, konumunu ve yapılandırmayı değiştirme. Yapısal DNA nanoteknolojisi ve DNA origamisinin özel tekniği, motor toplulukların iyi tanımlanmış mimarilerinin moleküler yapılışı sağlar. Yük yapılarının şekli, motorların tipi, sayısı ve yapısıüzerindeki yerleşimleri kontrol edilebilir. Burada, bu toplulukların üretilmesi ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanılarak gözlemleme için ayrıntılı protokoller salıyoruz. Bu teknikler özellikle sitoskelet motorlar için uygulanmış olsa da, bu yöntemler görevlerini yerine getirmek için kompleksler halinde biraraya gelen diğer proteinleriçin genelleştirilebilir. Genel olarak, motor proteinlerin iyi tanımlanmış topluluklar oluşturmak için DNA origami yöntemi acil hareketli davranış yol mekanizmaları diseksiyon için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Dynein ve kinesin ökaryotik hücrelerde sayısız fonksiyonlardan sorumlu sitoskeletal motor proteinlerdir1. ATP hidroluzunun kimyasal enerjisini verimli bir işe dönüştürerek, bu motorlar çeşitli hücre içi kargoları taşımak ve dağıtmak için mikrotübüller üzerinde transren. Ayrıca mitoz bölünmeile ilişkili büyük hücre içi yeniden düzenlemeleri koordine, onlar konumlandırma ve kromozomların ayrılmasına katkıda bulunan düzenlenmiş kuvvetler sergiler. Yapısal, biyokimyasal ve biyofiziksel tahliller, tek molekül gözlemleri de dahil olmak üzere, bireysel düzeyde bu motorların mekanizmaları ortaya koymuştur (öncekiçalışmalardaiyi gözden 2,3,4). Ancak, motorların görevlerinin çoğu, benzer ve karma motor tiplerinde küçük topluluklar halinde çalışmalarını gerektirir. Nispeten daha az bu toplulukların faaliyet ve nihai acil hareketlilik koordine mekanizmaları hakkında anlaşılmaktadır5,6. Bu bilgi boşluğu, kısmen, motor türü ve kopya numarası gibi denetlenebilir özelliklere sahip topluluklar oluşturmadaki güçlüklerden kaynaklanmaktadır. Son on yılda, DNA origami moleküler inşaat teknikleri bu sorunu çözmek için istihdam edilmiştir. Mikrotübül bazlı motorlar için, bu araştırmaların bazı örnekleri sitoplazmik dinamin topluluklarının tek molekülgözlemleri içerir-17,8,9, intraflagellar dynein11, çeşitli kinesin motorları12,13, ve hem dyneins ve kinesin karışımları7,14,15. Burada,maya7,16,17, 18,19,20, motorların saflaştırma ve oligonükleotid etiketleme ayrıntıları nı sağlamak katlanır ve tunable uyum ile segmentli DNA origami saflaştırma8, ve şasi yapıları itici maya motorların görüntüleme7,18.
In vitro tek molekül gözlem için motor toplulukları inşa üç birincil çaba gerektirir. Bunlardan ilki, DNA origamisine bağlanmaya uygun motor yapılarının ekspresyonu, saflaştırılması ve etiketlenmesidir. İkincisi, tanımlanmış DNA origami yapılarının üretimi ve saflaştırılmasıdır (genellikle “şasi” olarak adlandırılır). Ve üçüncüsü ise motorların şasi yapısına çekimi ve ardından toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopisi kullanılarak gözlemlenmesidir. Burada, maya Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18arındırılmış rekombinant mikrotübül bazlı motorlar için bu süreç için kurulan protokoller sağlamak, 19. DNA origami tabanlı motor topluluklar hem rekombinant kinesin15 ve dynein7,8,18 yapılar bu maya ifade sistemi16 üretilen kullanılarak araştırılmıştır ,17,18,19. Bu protokol, galaktoz indüklenen organizatör tarafından kontrol edildikleri ve saflaştırma (ZZ ve TEV proteaz bağlayıcısı) ve DNA oligo çekimi (SNAPtag) için aynı protein etiketlerine kaynaşmış olmaları göz önüne alındığında, bu yapılar için geçerlidir.
Belirli maya suşları belirli motor yapılar üretmek. Örneğin, kargo uyumunun rolünü incelemek için kullanılan dynein, RPY10847,8’denarındırıldı. Genel olarak, ekspresyon ve arınma için uygun genetik modifikasyonlar ile motor yapıları içeren suşlar, bu motorların kullanımını yayınlayan laboratuvarlardan istenebilir. Mutasyonlar veya etiketler gibi yeni özelliklere sahip yapılar lityum asetat dönüşümü21 ve ticari kitleri gibi rekombinant genetik teknikler kullanılarak yapılabilir. Tek moleküllü çalışmalar için mayamodi motor proteinleri oluşturmak için ayrıntılı protokoller yayınlanmıştır19. SNAPtag’a kaynaşmış motorlara ek olarak, motorları etiketlemek için kullanılan oligolar SNAP substratı benzilguanine (BG) konjuge edilmelidir; daha önce yayınlanan protokoller oluşumu ve BG-oligo conjugates arıtma açıklar18. Burada açıklanan genel strateji de aktin bazlı motorlar için istihdam edilmiştir (örnekler için önceki çalışmalara bakın22,23,24), ve diğer organizmalar ve ifade sistemlerinden arındırılmış motorlar (önceki bakınız örnekler için çalışır7,9,10,11,12,13,14).
Polimerize mikrotübüller (MTs) bu deneylerde iki farklı prosedürde kullanılmaktadır. Fonksiyonel motorların MT arinatifliği diğer fonksiyonel gruplarla etiketlenmeyen MT’ler gerektirirken, motor-topluluk hareketliliği TIRF tsayı biotin ve floroforlarla etiketlenmiş MT’ler gerektirir. Her durumda, MTs denatürasyonu önlemek için taxol ile stabilize edilir. MT yakınlık saflaştırma adımı, yüksek MT afinitesine sahip hareketli olmayan motorları kaldırmak için kullanılır, çünkü bu motorlar bir şasiye konjuge edilirse topluluk hareketliliğini değiştirebilir. Bu işlem sırasında, aktif motorlar MT’leri bağlar ve çözeltide kalır, sıkı bağlayıcı motorlar MT peletinde aşağı doğru döner. Bu, şasi üzerindeki tüm motorların aktif bir popülasyondan olmasını sağlamaya yardımcı olur.
Dna origami yapıları çeşitli sitosiskelet motor toplulukları çalışma için kullanılmıştır. Topluluk taşımacılığının mekanistik anlayışı arttıkça, deneylerde kullanılan DNA origami yapıları karmaşıklık içinde büyümüştür. Prensip olarak, herhangi bir yapı motorlar ve floroforlar için tek iplikli DNA eki siteleri içerecek şekilde modifiye edilmesi koşuluyla bu amaca uyarlanabilir. Belirli şasi tasarımları ve özellikleri motor topluluklarının acil davranışı hakkında belirli soruları araştırmak için yararlı olabilir. Örneğin, sert çubuklar kopya numarası nın dyneins ve kinesin takımları tarafından ulaşımı nasıl etkilediği ne kadar temel bilgi geliştirmek için kullanılmıştır7,15,18, ve 2D platformlar miyozin topluluğu nu incelemek için kullanılmıştır actin ağları nın navigasyon22. Değişken veya sabit esnekliğe sahip yapılar, motorlar arasındaki elastik bağlantının rollerini anlamak ve adımlama senkronizasyonunun hareketliliği nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılmıştır8,24. Daha yakın zamanlarda, küresel yapılar motor-parça bağlama geometrik kısıtlamaları hareketlilik25dinamiklerini nasıl etkilediğini içgörü kazanmak için kullanılmaktadır.
Bu protokolde, değişken rijitliğe sahip parçalı şasi üzerinde topluluk deneyleri için belirli adımlar sunuyoruz. Şasi üzerindeki bağlama siteleri bazen “kulplar” olarak adlandırılırken, bu kolları bağlayan tamamlayıcı DNA dizilerine “antihandles” denir. Bu şasi üzerindeki motor sayısı, segmentlerin oligo etiketli motorlarda antihandle oligo’ya tamamlayıcı olarak genişletilmiş sap zımbaları içerdiği ne göre belirlenir. Farklı segmentlerde farklı tutamaç dizilerinin kullanılması, farklı tipteki motorların şasi üzerindeki belirli konumlara bağlanmasına olanak tanır. Burada ayrıntılı şasi 7 sıralı sert segmentleri oluşur, her biri oluşan 12 çift iplikli DNA helikler 2 eşmerkezli halkalar8düzenlenmiş . Rijit segmentler motor tutamaçları içerir ve “bağlayıcı” zımbaların yokluğuna veya varlığına bağlı olarak esnek tek iplikli DNA veya çift iplikli DNA olabilecek bölgeler aracılığıyla bağlanır. Şasi yapısının uygunluğu böylece bu “bağlayıcı” zımbaların varlığı veya yokluğu ile belirlenir. Daha fazla bilgi ve belirli DNA dizileri8için önceki raporlara bakın. Buna ek olarak, birden fazla yöntem şasi26arındırmak için kullanılabilir. Rate-zonal gliserol gradyan santrifüj yöntemi27 burada açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA origami moleküler inşaat teknikleri tanımlanmış mimarileri, motor numaraları ve türleri ile motor topluluklar oluşturmak için benzersiz bir yol sağlar, nasıl acil davranış belirli motor yapılandırmaları31ortaya çıkar çalışmaları sağlayan. Yapısal ve hücresel çalışmalar ekipler halinde çalışan sitoskeletal motorların örneklerini açıklığa kavuşturmaya devam ettikçe, topluluklar halindeki motorların biyofiziksel ve biyokimyasal mekanizmalarını izole etme …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K. Chau, J. Morgan ve A. Driller-Colangelo’ya parçalı DNA origami şasisinin tekniklerine katkıda bulunanlara teşekkür ederiz. Ayrıca Reck-Peterson ve Shih laboratuvarlarının eski üyelerine bu tekniklerin orijinal gelişimine yararlı tartışmalar ve katkılar için teşekkür ederiz. J. Wopereis’e ve Smith College Mikroskobu ve Görüntüleme Merkezi’ne ve L. Bierwert’e ve Smith College Moleküler Biyoloji Merkezi’ne teşekkür ederiz. Bir TIRF mikroskobu satın alınması için NSF MRI programını minnetle kabul ediyoruz.
Materials
| 2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
| Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
| Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
| Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
| P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProTev Protease | Promega | V6101 | |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
| Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
| SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
| Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
- Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
- Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
- McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
- Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
- Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
- Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
- Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
- Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
- Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
- Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
- Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
- Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
- Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
- Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
- Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).
- Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
- Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).
- Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
- Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
- Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
- Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
- Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
- Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , (2019).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
