リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装
Summary
このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ベースのヒドロゲルに埋め込まれた蛍光線マーカーの3次元配列を製造するための多光子リソグラフィーを実装するための指示を提供し、参照フリー、トラクション力顕微鏡として使用します。プラットフォーム。これらの指示を使用して、3D材料ひずみの測定および細胞牽引の計算は高スループット牽引力の測定を促進するために簡単にされる。
Abstract
細胞誘発物質の変形を定量化すると、細胞が微小環境の物理的特性をどのように感知し、それに反応するかに関する有用な情報が提供されます。細胞誘発物質株を測定するための多くのアプローチが存在する一方で、ここでは、参照フリーの方法でサブミクロン分解能で歪みを監視するための方法論を提供します。2光子活性化フォトリソグラフィパターニングプロセスを用いて、蛍光線マーカーの埋め込み配列を含む機械的および生体的に微細に微細に誘導可能な合成基板を生成し、3次元を容易に測定する方法を示します(3D)サーフェストラクションに応答する材料変形プロファイル。これらの基質を使用して、セル張力プロファイルは、対象セルの単一の 3D イメージ スタックを使用してマッピングできます。この方法論の目標は、トラクションフォース顕微鏡検査をよりアクセスしやすく、細胞メカノトランスダクションプロセスを研究する研究者、特にこの分野の新規参入者のためのツールを実装しやすくすることです。
Introduction
牽引力顕微鏡(TFM)は、付着細胞および収縮細胞によって生成された受動マーカーの補間変位場を使用して細胞トラクションを近似するプロセスである。TFMを用いて、増殖、分化、および移行などの重要な細胞プロセスに対する細胞外環境における機械的手がかりの影響を調査することができる1、2、3、4 ,5,6,7,8,9,10,11,12.残念ながら、既存のアプローチの多くは実装が難しいか、高度に専門化された分析ツールや計算ツールに精通している必要があり、経験の浅い研究者が TFM を使用することは困難です。分析の難しさを解消しつつ、ハイスループットのデータ取得を提供するTFMプラットフォームを生成する方法論について述べた。
既存のTFMアプローチのうち、材料株の定量化に最も一般的に使用されるのは、ポリアクリルアミド(PAA)またはポリなどの変形可能なヒドロゲルに小さな蛍光マーカー(通常はナノまたはマイクロメートルサイズの蛍光ビーズ)を取り込むことを含む。(エチレングリコール) ダイアクリレート (PEGDA)13,14,15.これらのビーズベースのアプローチは、変位サンプリングを最大化するために、対象のセルの周りにフィデューシャルマーカーを密集させる機能を提供します。残念ながら、ヒドロゲル全体のビーズの分布を直接制御することはできないため、空間的な組織はランダムです。このランダムな配置は、ビーズが互いに近すぎて正確に解決できないなどの問題を引き起こしたり、基板のパッチが低品質のデータを生み出すように広がったりします。細胞が存在しない場合に、フィデューシャルマーカーがどこに存在するかを予測できないため、収集されたセルトラクションデータのセットごとに、緩和された状態で基になるマーカーの追加参照画像もキャプチャする必要があるという制約が生じます。強調されたイメージとストレスのないイメージの差として、強調されたイメージの変位を近似できるように、参照イメージが必要です。リラックスした状態を達成するために、測定される細胞は化学的にリラックスするか、または完全に除去される。このプロセスは、多くの場合、さらなる実験測定値の獲得を妨げ、長期細胞研究を阻害し、スループットを制限する。参照画像はまた、実験中に発生した可能性のあるドリフトに対応するために画像登録技術を必要とし、多くの場合、画像を参照するストレス状態画像の面倒な手動マッチングにつながります。
参照フリーとみなされる他のTFM法は、高解像度リソグラフィ、マイクロコンタクト印刷、またはマイクロモールディング16、17、18のいずれかによって、フィデューシャルマーカーの分布を何らかの形で制御する、19、20.リファレンスフリーTFMは、製造プロセス中にマーカー位置がどのように規定されたかに基づいて、各フィデューシャルマーカーの緩和状態を予測できるという仮定によって達成される。これらの方法は、フィデュースマーカーの変位が、フィデュースマーカージオメトリから推測できるよりも暗黙的な参照と比較して測定される単一の画像キャプチャ内でセルの張力状態を完全にキャプチャすることを可能にします。マーカー配置の一貫性は通常、これらのプラットフォームを使用して達成されますが、一般的に、1)トラクション解像度の低下を含む広く使用されているビーズベースのアプローチに対する独自の欠点に苦しんでいます。2)平面外変位の精度の低下(場合によっては完全に測定できない)。そして3)プラットフォーム基板および材料のカスタマイズ性の低下(例えば、リガンド提示、機械的特性)。
これらの欠点に対処するために、新しいリファレンスフリー TFM プラットフォームを設計しました。このプラットフォームは、マルチフォトン活性化化学を利用して、材料の歪みを測定するためのフィデューシャルマーカーとして機能するヒドロゲル内の特定の3D位置に蛍光素の少量を架け取ります。このように、我々はビーズベースのアプローチと同様に動作するプラットフォームを設計しましたが、フィデューシャルマーカーがグリッド化された配列に編成され、参照フリーの材料ひずみ追跡を可能にするという大きな利点があります。このリファレンスフリーのプロパティは、多くの利点を提供します。まず第一に、細胞トラクション状態の非侵入的なモニタリングを可能にする(すなわち、細胞をリラックスまたは除去する必要性を回避し、変位した受託マーカーの参照位置を獲得する必要を回避する)。これは、破壊的なエンドポイントTFMアプローチでは困難なTFMと組み合わせて他の下流分析方法を組み込むことを意図したので、このシステムを設計する上で私たちの主な目標でした。次に、グリッド配列に基づく暗黙的な参照を使用すると、変位解析のほぼ完全な自動化が可能になります。配列の規則性は、例外的なケースの発生 (つまり、最適でないマーカー間隔や登録の不一致など、予期しないアーティファクトを含むサンプルセル データ) を最小限に抑えることができる予測可能なワークフローを作成します。第3に、参照画像を取得する必要性を持つ場合は、長期間にわたって単一のサンプル上の多くのセルを自由に監視できます。これは従来のビーズベースのアプローチとは対照的で、顕微鏡の自動ステージの動きの忠実さに応じて、位置決めの誤差が蓄積し、細胞張力に基準画像を適切に登録する難易度を高めることができます。画像。全体的に、このプラットフォームは、細胞張力データを収集する上で高いスループットを容易にします。
このプロトコルを使用して、我々は、種子細胞によって生成された平面外のトラクション成分を測定するために、このリファレンスフリーTFMプラットフォームを生成するために実装した2光子、レーザースキャニングリソグラフィ技術を読者に理解したいと考えています。表面に。このプロトコルではカバーされていないのは、一部の単量体成分の合成である。一般に、これらの反応は、前述の21とほぼ同一の「ワンポット」合成反応スキームを含み、これらの製品に代わるものも購入することができる。また、市販のレーザー走査顕微鏡を3D印刷ツールとして使用し、受託マーカー変位の解析を容易にするために、生成したソフトウェアベースのツールを読者に理解することを目指しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの目的は、TFM データの生成と分析に関連する困難の多くを軽減するワークフローを提供することです。一度調製されると、フォトパターン化されたヒドロゲルは使いやすく、標準的な組織培養慣行と蛍光顕微鏡の知識のみを必要とします。リファレンスフリーのアスペクトにより、セルを含むヒドロゲルの気楽なナビゲーションが可能になり、参照画像と変形画像間の画像登…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
バンダは、NSF IGERT SBE2フェローシップ(1144726)、デラウェア大学が提供するスタートアップファンド、国立衛生・国立がん研究所IMATプログラム(R21CA214299)からの資金提供を受けました。JHSは、国立衛生研究所/国立がん研究所IMATプログラム(R21CA214299)と国立科学財団キャリア賞プログラム(1751797)からの資金援助を受けています。顕微鏡検査アクセスは、NIH-NIGMS(P20 GM103446)、NSF(IIA-1301765)およびデラウェア州からの助成金によってサポートされました。構造化照明顕微鏡は、デラウェア州連邦研究開発助成プログラム(16A00471)からの資金で取得されました。2光子レーザー走査リソグラフィに使用されるLSM880共焦点顕微鏡は、共有計装交付金(S10 OD016361)で取得されました。
Materials
| Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips | in-house | in-house | Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24 |
| Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM. | |
| Chameleon Vision ii | Coherent Inc. | Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography. | |
| Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | 3M | Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes. | |
| Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter. |
| LSM-880 | Zeiss | Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography. | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data. |
| Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes. |
| Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM. | |
| PEG-AF633 | in-house | in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21 |
| PEG-DA | in-house | in-house | Base material for hydrogels. See reference: 21 |
| PEG-RGDS | in-house | in-house | RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21 |
| Petri Dishes | CELLTREAT | 229638 | 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS). |
| Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| UV Lamp | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Polymerizes base hydrogel. |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography. |
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