Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması
Summary
Bu protokol, referanssız, çekiş kuvveti mikroskobu olarak kullanılmak üzere poli (etilen glikol) bazlı hidrojellere gömülü üç boyutlu floresan fidüyal belirteçdizilerini imal etmek için multifoton litografinin uygulanması için talimatlar sağlar. Platform. Bu talimatlar kullanılarak, 3B malzeme gerinimölçümü ve hücresel çekişlerin hesaplanması, yüksek iş gücü kuvveti ölçümlerini teşvik etmek için basitleştirilmiştir.
Abstract
Hücre kaynaklı malzeme deformasyonunun ölçülmesi, hücrelerin mikro çevrelerinin fiziksel özelliklerini nasıl algılayıp tepki verdikleri hakkında yararlı bilgiler sağlar. Hücre kaynaklı malzeme gerilmelerini ölçmek için birçok yaklaşım mevcut olmakla birlikte, burada sub-mikron çözünürlüğü ile gerinimin referanssız bir şekilde izlenmesi için bir metodoloji salıyoruz. İki fotonlu aktif fotolitografik desenleme işlemini kullanarak, üç boyutlu () üç boyutlu olarak kolayca ölçmek için, floresan fiducial belirteçlerin gömülü dizilerini içeren mekanik ve biyo-aktif olarak tunable sentetik yüzeylerin nasıl üretilebildiğini gösteriyoruz. Yüzey çekişlerine yanıt olarak 3D) malzeme deformasyon profilleri. Bu yüzeyler kullanılarak, hücre gerilimi profilleri ilgi bir hücrenin tek bir 3B görüntü yığını kullanılarak eşlenebilir. Bu metodoloji ile amacımız, özellikle alana yeni gelen hücresel mekanotransdüksiyon süreçlerini inceleyen araştırmacılar için çekiş kuvvetini mikroskobu daha erişilebilir ve uygulaması daha kolay hale getirmektir.
Introduction
Çekiş kuvveti mikroskobu (TFM), yapışık ve kontraktil hücre tarafından oluşturulan fiduyal belirteçlerin enterpolasyonlu yer değiştirme alanlarını kullanarak hücresel çekişlere yaklaşma işlemidir. TFM kullanılarak, hücre dışı ortamdaki mekanik ipuçlarının çoğalma, farklılaşma ve göç gibi önemli hücresel süreçler üzerindeki etkisi1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Ne yazık ki, mevcut pek çok yaklaşımın uygulanması zor olabilir veya tfm’nin deneyimsiz araştırmacıların kullanmasını zorlaştıran son derece özel analitik ve hesaplamalı araçlara aşinalık gerektirmektedir. Yüksek iş hacmi ne kadar veri toplama sağlarken, aynı zamanda analizdeki bazı zorlukları ortadan kaldıran bir TFM platformu oluşturmak için bir metodoloji tanımlıyoruz.
Mevcut TFM yaklaşımları arasında, malzeme geriniminin ölçülmesinde en yaygın olarak kullanılan, poliakrilamid (PAA) veya poli gibi deforme edilebilir bir hidrojele küçük floresan belirteçlerin (genellikle nano veya mikrometre boyutunda floresan boncuklar) eklenmesidir. (etilen glikol) diakrilat (PEGDA)13,14,15. Bu boncuk tabanlı yaklaşımlar, yer değiştirme örneklemesini en üst düzeye çıkarmak için bir ilgi hücresi etrafında fiducial belirteçleri yoğun bir şekilde kümeleme olanağı sağlar. Ne yazık ki, hidrojel boyunca boncuk dağılımı doğrudan bu yüzden mekansal organizasyon rasgele kontrol edilemez. Bu rasgele yerleşim, doğru bir şekilde çözmek için birbirlerine çok yakın boncuklar gibi sorunlara yol açar, ya da böylece substrat yamaları düşük kaliteli veri verim yayıldı. Hücrelerin yokluğunda güvenilir belirteçlerin nerede yattığını tahmin edememe, toplanan her hücre çekiş verisi kümesi için, rahat bir durumda temel işaretçilerin ek bir referans görüntüsünün de yakalanması gereken bir kısıtlama oluşturur. Vurgulanmış görüntüdeki yer değiştirmenin stresli ve vurgusuz görüntüler arasındaki fark olarak yaklaşık olarak tahmin edilebilmeleri için referans görüntüsü gereklidir. Rahat bir duruma ulaşmak için, ölçülen hücreler ya kimyasal olarak rahatya alınır ya da tamamen kaldırılır. Bu süreç genellikle daha fazla deneysel ölçümlerin elde etmesini engeller, uzun süreli hücre çalışmalarını engeller ve iş hacmini sınırlar. Bir referans görüntü de deneme sırasında meydana gelmiş olabilir sürüklenme karşılamak için görüntü kayıt teknikleri gerektirir, genellikle referans görüntüleri stres durumu görüntüleri hantal manuel eşleştirme yol açan.
Referanssız kabul edilen diğer TFM yöntemleri, yüksek çözünürlüklü litografi, mikrotemas baskı veya mikromolding16,17,18 ile fiducial belirteçlerin dağıtımı üzerinde bir çeşit kontrol uygulayın ,19,20. Referanssız TFM, her bir fiducial işaretleyici için rahat durumunun, üretim işlemi sırasında marker konumlarının nasıl reçete edildiğine bağlı olarak tahmin edilebildiği varsayımıyla elde edilir. Bu yöntemler, bir hücrenin gerilim durumunun, fiducial marker geometrisinden çıkarılabilen ima edilen bir referansla karşılaştırıldığında ölçüldüğü tek bir görüntü yakalama içinde tam olarak yakalanmasını sağlar. Marker yerleştirmede tutarlılık genellikle bu platformlar kullanılarak elde edilirken, genellikle yaygın olarak kullanılan boncuk tabanlı yaklaşımlara göre kendi eksikliklerinden muzdariptir: 1) azalmış çekiş çözünürlüğü; 2) uçak dışı yer değiştirmelerin doğruluğunda azalma (bazı durumlarda ölçülemezlik); ve 3) platform yüzeyleri ve malzemelerinin (örn. ligand sunumu, mekanik özellikler) özelleştirilebilirliğini azalttı.
Bu eksiklikleri gidermek için yeni bir referanssız TFM platformu tasarladık. Platform, hidrojel içinde bir florofor küçük bir hacim liorofor küçük bir hacim malzeme gerginliği ölçmek için güvenilir belirteçleri olarak hizmet veren belirli 3D yerlere çapraz bağlantı multifoton aktif kimya kullanır. Bu şekilde, boncuk bazlı yaklaşımlara benzer şekilde çalışan bir platform tasarladık, ancak fiduyal belirteçlerin referanssız malzeme gerinim takibine olanak tanıyan ızgaralı diziler halinde düzenlenmesi nin önemli yararıyla. Bu referanssız özellik birçok avantaj sağlar. Her şeyden önce, hücresel çekiş durumlarının müdahaleci olmayan izlenmesine izin verir (örneğin, yerinden edilmiş fiducial belirteçlerin referans konumlarını elde etmek için hücreleri gevşetme veya kaldırma ihtiyacını ortadan kaldırır). Bu sistemi tasarlamaktaki temel hedefimiz buydu, çünkü yıkıcı son nokta TFM yaklaşımları ile zor olabilecek Diğer aşağı analitik yöntemleri TFM ile birlikte dahil etmeyi amaçladık. İkinci olarak, ızgaralı dizilere dayalı zımni bir referans kullanmak, yer değiştirme analizinin neredeyse tam otomasyonuna olanak sağlar. Dizilerin düzenliliği, olağanüstü durumların (örneğin, suboptimal işaretçi aralığı veya kayıt uyuşmazlıkları gibi beklenmeyen yapıları içeren örnek hücre verilerinin) en az tutulabileceği öngörülebilir bir iş akışı oluşturur. Üçüncü olarak, bir referans görüntü elde etme ihtiyacının aşması, uzun bir süre boyunca tek bir örneküzerinde birçok hücreyi izleme özgürlüğü sağlar. Bu, mikroskobun otomatik sahne hareketlerinin doğruluğuna bağlı olarak konumlandırmadaki hataların birikebileceği ve referans görüntülerin hücre gerilimine düzgün bir şekilde kaydedilmesinin zorluğunu artırabildiği geleneksel boncuk tabanlı yaklaşımlarla tezat oluşturuyor. Görüntü. Genel olarak, bu platform hücresel gerilim verilerinin toplanmasında daha yüksek iş verisi kolaylaştırır.
Bu protokolle okuyucuları, tohumlu hücreler tarafından oluşturulan düzlem içi ve düzlem dışı çekiş bileşenlerini ölçmek için bu referanssız TFM platformünü oluşturmak için uyguladığımız iki fotonlu lazer tarama litografi tekniğini tanımayı umuyoruz. yüzeyinde. Bu protokolde yer almayan bazı monomerik bileşenlerin sentezidir. Genel olarak, bu reaksiyonlar daha önce açıklanan hemen hemen aynı “tek pot” sentez reaksiyon şemaları içerir21, ve bu ürünlere alternatifler de satın alınabilir. Ayrıca, ticari olarak kullanılabilen lazer taramalı mikroskopların 3D baskı araçları olarak kullanımını teşvik etmek ve güvenilir işaretli yer değiştirmelerin analizini kolaylaştırmak için oluşturduğumuz yazılım tabanlı araçlarla okuyucuları bilgilendirmeyi amaçlıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün amacı, TFM verilerinin üretimi ve analizi ile ilgili zorlukların çoğunu hafifleten bir iş akışı sağlamaktır. Bir kez hazırlanan, fotodesenli hidrojeller kullanımı basit, standart doku kültürü uygulamaları ve floresan mikroskopi sadece bilgi gerektiren. Referanssız yönü hücre yüklü hidrojeller üzerinde kaygısız navigasyon sağlar ve referans ve deforme görüntüler arasında görüntü kaydı gibi hantal görüntü işleme adımları ortadan kaldırır. Elde edilen analiz neredey…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O. A. Banda, NSF IGERT SBE2 bursu (1144726), Delaware Üniversitesi tarafından sağlanan başlangıç fonları ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Kanser Enstitüsü IMAT Programı (R21CA214299) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. JHS, Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Kanser Enstitüsü IMAT Programı (R21CA214299) ve National Science Foundation CAREER Award Program (1751797) tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi erişimi NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) ve Delaware Eyaleti’nden gelen hibelerle desteklenmiştir. Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu, Delaware Eyaleti Federal Araştırma ve Geliştirme Hibe Programı’ndan (16A00471) gelen fonlarla satın alınmıştır. İki foton lazer tarama litografisinde kullanılan LSM880 konfokal mikroskobu ortak bir enstrümantasyon hibesi (S10 OD016361) ile elde edilmiştir.
Materials
| Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips | in-house | in-house | Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24 |
| Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM. | |
| Chameleon Vision ii | Coherent Inc. | Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography. | |
| Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | 3M | Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes. | |
| Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter. |
| LSM-880 | Zeiss | Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography. | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data. |
| Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes. |
| Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM. | |
| PEG-AF633 | in-house | in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21 |
| PEG-DA | in-house | in-house | Base material for hydrogels. See reference: 21 |
| PEG-RGDS | in-house | in-house | RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21 |
| Petri Dishes | CELLTREAT | 229638 | 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS). |
| Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| UV Lamp | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Polymerizes base hydrogel. |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography. |
References
- Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
- Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).
- Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103 (2015).
- Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).
- Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).
- Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
- Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).
- Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).
- Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).
- Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).
- Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).
- Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).
- Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).
- Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).
- . Slater Lab Code Repositories Available from: https://github.com/SlaterLab (2019)
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).
- Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).
- Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).
