Erzeugung von Porcine Hodenorganoiden mit Testis-spezifischer Architektur mit Microwell-Kultur

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur reproduzierbaren Erzeugung von Schweinehodenorganoiden mit Testis-spezifischer Gewebearchitektur unter Verwendung des handelsüblichen Mikrowell-Kultursystems vor.

Abstract

Organoide sind dreidimensionale Strukturen, die aus mehreren Zelltypen bestehen, die in der Lage sind, Gewebearchitektur und Funktionen von Organen in vivo zu rekapitulieren. Die Bildung von Organoiden hat verschiedene Wege der Grundlagen- und Translationsforschung eröffnet. In den letzten Jahren haben Hodenorganoide Interesse auf dem Gebiet der männlichen Reproduktionsbiologie geweckt. Hodenorganoide ermöglichen die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, Gewebeentwicklung und der Keimzellnische Mikroumgebung und ermöglichen das Screening von Arzneimitteln und Toxizitäten mit hohem Durchsatz. Eine Methode ist erforderlich, um Hodenorganoide mit Hoden-spezifischer Gewebearchitektur zuverlässig und reproduzierbar zu erzeugen. Das Mikrobrunnenkultursystem enthält eine dichte Reihe von pyramidenförmigen Mikrobrunnen. Hodenzellen, die aus präpubertären Hoden gewonnen werden, werden in diese Mikrobrunnen zentrifugiert und kultiviert, um Hodenorganoide mit hodenspezifischer Gewebearchitektur und Zellassoziationen zu erzeugen. Tausende von homogenen Organoiden können über diesen Prozess erzeugt werden. Das hier berichtete Protokoll wird für Forscher, die die Männliche Fortpflanzung untersuchen, von breitem Interesse sein.

Introduction

In den letzten Jahren ist das Interesse an dreidimensionalen (3D) Organoiden wieder gestiegen. Verschiedene Organe wie Darm¹, Magen², Bauchspeicheldrüse^3,4, Leber⁵und Gehirn⁶ wurden erfolgreich in 3D-Organoid-Systeme abgeleitet. Diese Organoide haben architektonische und funktionelle Ähnlichkeiten mit den Organen in vivo und sind biologisch relevanter für die Untersuchung der Gewebemikroumgebung als monolayer Kultursysteme⁷. Als Ergebnis, Hodenorganoide haben begonnen, Interesse zu gewinnen sowie^8,9,10,11,12. Die meisten bisher gemeldeten Methoden sind komplex, nicht hoher Durchsatz¹⁰ und erfordern die Zugabe von ECM-Proteinen^8,10. Diese Komplexität führt auch zu Problemen mit der Reproduzierbarkeit. Es wird eine einfache und reproduzierbare Methode benötigt, die die Erzeugung von Hodenorganoiden mit Zellassoziationen ermöglicht, die wie Hoden in vivo sind.

Wir haben vor kurzem ein System gemeldet, um diese Anforderungen zu erfüllen¹². Unter Verwendung des Schweins als Modell verwendeten wir einen zentrifugalen erzwungenen Aggregationsansatz im Mikrowell-System. Im Mikrowell-System enthält jeder Brunnen eine große Anzahl identischer kleinerer Mikrobrunnen¹³. Dies ermöglicht die Erzeugung zahlreicher Sphäroide einheitlicher Größe. Das Microwell-System ermöglichte die Erzeugung einer großen Anzahl einheitlicher Organoide mit einer testis-spezifischen Architektur. Das System ist einfach und erfordert keine Zugabe von ECM-Proteinen.

Protocol

HINWEIS: Die Hoden von einwöchigen Ferkeln wurden von einer gewerblichen Schweinehaltung als Nebenprodukt aus der Kastration von Handelsschweinen gewonnen. Die Beschaffung von Hoden wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary genehmigt. 1. Herstellung von Enzymlösungen für die Gewebeverdauung HINWEIS: Es werden drei verschiedene enzymatische Lösungen benötigt, die zwei verschiedene Kollagenase-IV-Lösungen (Lösung A, B) und eine Desoxyribonuklease-…

Representative Results

Isolierte Zellen aus 1 Wochen alten Schweinehoden, die in den Mikrobrunnen selbst organisiert in Sphäroide kultiviert wurden (Abbildung 1A, Abbildung 2), mit abgegrenzten und ausgeprägten äußeren (seminiferen Epithel) und Innenfächern ( interstitium) (Abbildung 1B, Abbildung 2). Die beiden Fächer wurden durch eine Kollagen-IV+…

Discussion

Wir haben eine einfache Methode etabliert, die die konsistente, wiederholbare Erzeugung einer großen Anzahl von Hodenorganoiden mit Gewebearchitektur ermöglicht, die Hoden in vivo¹²ähnelt. Während der Ansatz mit Schweine-Hodenzellen entwickelt wurde, ist er breiter angelegt auch auf Maus, nicht-menschliche Primaten und menschliche Hoden¹²anwendbar. Für die Herstellung von Hodenorganoiden 8^,9,<sup cla…

Materials

100 mm ultra low attachment tissue culture dish	Corning	#CLS3262
100 mm tissue culture dish	Corning	#353803
Aggrwell 400	Stemcell Technologies	#34411
Anti-Adherence Rinsing Solution	Stemcell Technologies	#07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	#C5138	referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington	Worthington-Biochem	#LS004189	referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	#DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12	Gibco	#11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	#D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	#D8537
Epidermal Growth Factor	R&D Systems	#236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm	FisherScientific	#352350
Falcon Cell Strainers 40 µm	FisherScientific	#352340
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	#12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	#41400-045
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	#P4333
Porcine testicular tissue	Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	#SCGP00525
Trypsin-EDTA	Sigma	#T4049