الأصلي بولياكرياميد هلام الكهربائي تحليل المناعية لIRF5 الذاتية الثنائية
Summary
ويوصف أسلوب لطخه الغربية المحلية لتحليل الذاتية مضاده للفيروسات عامل التنظيمية 5 ديميريشن في خط الخلايا الجذعية كال-1 بلازجيري. يمكن تطبيق هذا البروتوكول علي خطوط الخلايا الأخرى أيضا.
Abstract
العامل التنظيمي المضاد للفيروسات 5 (IRF5) هو عامل نسخ رئيسي لتنظيم الاستجابة المناعية. يتم تنشيطه في المصب من مستقبلات مثل الرقم المرجعي التمايز الأساسي استجابه الجينات 88 (TLR-MyD88) يشير المسار. وينطوي التنشيط IRF5 علي الفوسفات ، والتحوير ، والانتقال اللاحق من السيتوبلاسما إلى النواة ، مما يؤدي بدوره إلى التعبير الجيني لمختلف السايتوكينات الموالية للالتهابات. فحص الكشف عن تنشيط IRF5 ضروري لدراسة وظائف IRF5 ومساراتها ذات الصلة. توضح هذه المقالة فحص قويه للكشف عن التنشيط IRF5 الذاتية في خط الخلية البشرية الخلايا الجذعية (pDC) CAL-1. ويتكون البروتوكول من فحص الكهربي غير التقليدي المعدل الذي يمكن ان يميز IRF5 في اشكاله المومير والديمر ، التالي يوفر نهجا بأسعار معقولة وحساسة لتحليل IRF5 التنشيط.
Introduction
العامل التنظيمي المضاد للفيروسات 5 (IRF5) هو منظم النسخ الهامه التي تلعب دورا بارزا في تنظيم الاستجابة المناعية ، وخاصه في الإفراج عن السايتوكينات الموالية للالتهابات والتداخل من النوع الأول (ifns)1،2 ،3. سوء تنظيم IRF5 هو عامل المساهمة في العديد من امراض المناعة الذاتية, كما يتضح من مختلف اشكال التعدد في الموضع IRF5 التي ترتبط مع الذئبه الحماميه الجهازية, التصلب المتعدد, التهاب المفاصل الروماتويدي, الخ.4, 5،6،7،8،9،10. ولذلك ، فان فحص الكشف القوي لحاله التنشيط IRF5 الذاتية أمر حاسم لفهم المسارات التنظيمية والآثار النهائية لIRF5 في سياق خلوي ذي صله من الناحية الفسيولوجية.
يتم التعبير عن IRF5 بشكل دستوري في الخلايا الاحاديه ، والكريات الجذعية (DCs) ، والخلايا B ، والضامة1،11. كما هو الحال مع غيرها من عوامل النسخ الاسره IRF, IRF5 يقيم في سيتوتوبلاسما في حالتها الكامنة. عند التنشيط ، IRF5 هو الفوسفارلاتيد واشكال الhomodimers ، والتي بعد ذلك translocate في النواة وربط لعناصر تنظيميه محدده من نوع ترميز الجينات I IFNs والموالية للالتهابات السايتوكينات ، وحمل في نهاية المطاف التعبير عن هذه الجينات1 ،2،11،12،13. ينظم IRF5 الاستجابات المناعية الفطرية في المصب من مختلف المستقبلات التي تشبه الحصيلة (tlrs) ، مثل TLR7 ، tlrs 8 ، و tlrs 9 ، والتي هي مترجمه في التنظير الباطني واستخدام MyD88 للاشاره1،11،14. هذه tlrs تعترف في المقام الأول أنواع الأحماض النووية الاجنبيه مثل الجيش النيبالي الوحيد الذي تقطعت به السبل (أسانا) والحمض النووي cpg unmethylated التي هي اعراض للعدوى15,16,17,18. وقد ثبت IRF5 لتنظيم الاستجابات المناعية ضد العدوى البكتيرية والفيروسية والفطرية19،20،21. النظر في IRF5’s دور مؤثره ومتنوعة في الجهاز المناعي, تعزيز أو الملطف IRF5 النشاط يمكن ان تكون بمثابه وسيله جديده لتطوير العوامل العلاجية22. ومن ثم ، من الاهميه بمكان وضع بروتوكول لرصد حاله تفعيل الIRF5 الذاتية للسماح باجراء تحقيق شامل في المسارات واليات التي تنظم نشاط IRF5 في مختلف أنواع الخلايا.
إلى أفضل ما لدينا من المعرفة ، وقد نشرت اي البيوكيميائية أو هلام الفحص الكهربي لتنشيط IRF5 الذاتية قبل تطوير هذا البروتوكول. وقد تبين ان الفوسفات خطوه اولي هامه من IRF5 التنشيط ، وتم تطوير الأجسام المضادة IRF5 فوسفوسيبيفيك التي أدت إلى اكتشاف وتاكيد بقايا سيرين المهم لنشاط IRF513. ومع ذلك ، في حين ان الأجسام المضادة بوضوح بالكشف عن IRF5 فوسفولات عندما إيمونوبريسيبيتاتيد أو اوفيريكسبريسيد23، فانه يفشل في الكشف عن IRF5 فوسفولات في خليه كامله محلله في ايدينا (البيانات لم تظهر). ديميريشن هو الخطوة التالية من تفعيل IRF5 ، والعديد من الدراسات الهامه حتى الآن التحقيق في هذه الخطوة تعتمد علي الإفراط في التعبير عن الIRF5 الموسومة ، في كثير من الأحيان في أنواع الخلايا غير ذات الصلة التي لا تعبر عاده IRF511،12 و24و25. وقد أظهرت الدراسات السابقة ان IRF5 dimerized قد لا translocate دائما في النواةالتالي ليس بالضرورة تفعيلهابالبالكامل 25,26. تم تطوير فحص لتوطين النووية IRF5 الذاتية لتقييم IRF5 التنشيط عن طريق التصوير الخلوي التدفق27. وقد تم تطبيق هذا الفحص في الدراسات التي كانت حاسمه لفهم النشاط IRF5 ، وخاصه في أنواع الخلايا الاوليه أو النادرة28،29 ومتقدمة إلى حد كبير المعرفة في الميدان. ومع ذلك ، يعتمد هذا الفحص علي أداه متخصصة ليست متاحه علي نطاق واسع للباحثين. وعلاوة علي ذلك ، غالبا ما يكون من الضروري التحقيق في الخطوات الاوليه للتنشيط اثناء تشريح IRF5 المسارات التنظيمية وتحديد الجهات التنظيمية التمهيدية ومكونات المسار. توفر هذه الدراسة فحصا بيوكيميائيا قويا وموثوقا به لاحداث التنشيط المبكرة لIRF5 التي يمكن أداؤها في المختبرات المجهزة باداات البيولوجيا الجزيئية. البروتوكول الموصوف هنا سيكون مفيدا جدا في التحقيق في مسارات واليات IRF5 الإجراءات ، وخاصه عندما يقترن باختبارات متعامدة مثل تحليل تدفق التصوير الخلوي لIRF5 النووية23، 27و28و30.
الأصلي بولياكرياميد هلام الكهربائي (الصفحة الاصليه) هو أسلوب يستخدم علي نطاق واسع لتحليل مجمعات البروتين31،32. علي عكس الصوديوم دوديسيلكبريتات بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) ، الصفحة الاصليه تفصل البروتينات علي أساس شكلها وحجمها ، وتهمه. كما انه يحتفظ بنيه البروتين الأصلي دون التشبع31,33,34,35. البروتوكول المقدمة يستفيد من هذه الميزات من الصفحة الاصليه ويكتشف كلا من موحودي و ديميريك اشكال IRF5. هذا الأسلوب مهم بشكل خاص للكشف عن احداث التنشيط في وقت مبكر لأنه لا يوجد الأجسام المضادة المتاحة تجاريا المناسبة التي يمكن الكشف عن الذاتية فوسفوريلاتيد IRF5. في السابق ، استخدمت العديد من الدراسات المنشورة الصفحة الاصليه لتقييم IRF5 ديميريشن. ومع ذلك ، فان غالبيه هذه الدراسات تعتمد علي الإفراط في التعبير الخارجي-الموسومة IRF5 لتحليل حاله التنشيط2،13،24،36،37 . يقدم هذا العمل بروتوكول خطوه بخطوه لتحليل IRF5 الذاتية عن طريق أسلوب الصفحة الاصليه المعدلة في الخلية البشرية الجذعية (pDC) خط ، حيث تم إظهار نشاط IRF5 ان تكون حاسمه لوظيفتها1، 38،39،40. وقد تم تطبيق هذه التقنية نفسها علي خطوط الخلايا الأخرى23.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا هو الصفحة الاصليه المعدلة التي تميز كل من الاشكال الاحاديه والديميريكه لIRF5 الذاتية. كانت هناك دراسات قليله الإبلاغ عن الكشف عن التنشيط IRF5 الذاتية باستخدام تقنيه التصوير تدفق الخلوية المتخصصة23,27,28,3…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم العمل بتمويل من مؤسسه الرابض والصناديق الناشئة في جامعه المدينة. نشكر جميع أعضاء مختبر تشاو للمساعدة في التجربة والقراءة النقدية للمخطوطة.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
References
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O’Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios – Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochimie. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
