En Native Western blot metode til at analysere endogene interferon regulerende faktor 5 denne i CAL-1 plasmacytoid dendritiske cellelinje er beskrevet. Denne protokol kan også anvendes på andre cellelinjer.
Interferon reguleringsfaktor 5 (IRF5) er en vigtig transkriptionsfaktor til regulering af immunresponset. Det er aktiveret downstream af den Toll-lignende receptor myeloid differentiering primære respons gen 88 (TLR-MyD88) signalering pathway. IRF5 aktivering involverer fosforylering, dimerization, og efterfølgende translokation fra cytoplasmaet ind i kernen, som igen inducerer genekspression af forskellige pro-inflammatoriske cytokiner. En detekterings analyse for IRF5 aktivering er afgørende for at studere IRF5 funktioner og dens relevante veje. Denne artikel beskriver en robust analyse til at detektere endogene IRF5 aktivering i CAL-1 Human plasmacytoid dendritiske Cell (pDC) linje. Protokollen består af en modificeret nondenatururing elektroforese assay, der kan skelne IRF5 i sin monomer og dimer former, og dermed give en overkommelig og følsom tilgang til at analysere IRF5 aktivering.
Interferon reguleringsfaktor 5 (IRF5) er en vigtig transskription regulator, der spiller en fremtrædende rolle i reguleringen af immunresponset, især i frigivelsen af pro-inflammatoriske cytokiner og type I Interferoner (ifns)1,2 ,3. Fejl regulering af IRF5 er en medvirkende faktor i talrige autoimmune sygdomme, som tydeligt af forskellige polymorfier i IRF5 locus, der er forbundet med systemisk lupus erythematosus, multipel sklerose, reumatoid arthritis, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Derfor er en robust detekterings analyse for endogene IRF5 aktiveringstilstand afgørende for forståelsen af regulerings veje og downstream-effekter af IRF5 i en fysiologisk relevant cellulær kontekst.
IRF5 udtrykkes konstitutivt i monocytter, dendritiske celler (DCs), B-celler og makrofager1,11. Som med andre IRF familie transkriptionsfaktorer, IRF5 opholder sig i cytoplasmaet i sin latente tilstand. Ved aktivering, IRF5 er fosforyleret og danner homodimers, som derefter translokeres i kernen og binde til specifikke regulerende elementer af gener kodning type jeg IFNs og pro-inflammatoriske cytokiner, i sidste ende inducerende ekspression af disse gener1 ,2,11,12,13. IRF5 regulerer den medfødte immunrespons nedstrøms for forskellige bompenge-lignende receptorer (TLRs), såsom TLR7, TLR 8, og TLR 9, som er lokaliseret i endosomes og bruge MyD88 til signalering1,11,14. Disse tlr’er genkender primært fremmede nukleinsyre arter såsom enkeltstrenget RNA (ssrna) og umethyleret CPG-DNA, der er symptomatisk for en infektion15,16,17,18. IRF5 har vist sig at regulere immunresponset mod bakterielle, virale og svampeinfektioner19,20,21. Overvejer IRF5’s indflydelsesrige og forskelligartede rolle i immunsystemet, øge eller dæmpe IRF5 aktivitet kan tjene som en roman Avenue for udvikling af terapeutiske agenter22. Derfor er det afgørende at udvikle en protokol til at overvåge aktiveringsstatus af endogene IRF5 for at muliggøre grundig undersøgelse af de veje og mekanismer, der regulerer IRF5 aktivitet i forskellige celletyper.
Efter vores bedste overbevisning er ingen biokemisk eller gel elektroforetisk analyse for endogen IRF5 aktivering blevet offentliggjort forud for udviklingen af denne protokol. Fosforylering har vist sig at være et vigtigt første trin i IRF5 aktivering, og der blev udviklet et phosphospecific IRF5-antistof, som førte til opdagelsen og bekræftelsen af en Serin-rest, som er vigtig for IRF5 aktivitet13. Men, mens antistoffet klart registrerer fosforyleret IRF5 når immunoprecipitated eller overudtrykt23, det undlader at opdage IRF5 fosforylering i en hel celle lysat i vores hænder (data ikke vist). Dimerization er det næste trin i IRF5 aktivering, og mange vigtige undersøgelser til dato undersøger dette skridt er baseret på overekspression af epitope-mærkede IRF5, ofte i irrelevante celletyper, der normalt ikke udtrykker IRF511,12 ,24,25. Tidligere undersøgelser har vist, at dimerized IRF5 ikke altid omplacere sig i kernen og dermed ikke nødvendigvis fuldt aktiveret25,26. En analyse for endogene IRF5 nukleare lokalisering blev udviklet for at vurdere IRF5 aktivering af Imaging flow flowcytometri27. Denne analyse er blevet anvendt i undersøgelser, der var afgørende for at forstå IRF5 aktivitet, især i primære eller sjældne celletyper28,29 og i høj grad avanceret viden på området. Men, denne analyse bygger på et specialiseret instrument, der ikke er alment tilgængelige for forskere. Endvidere er det ofte nødvendigt at undersøge de indledende aktiverings trin, samtidig med at man dissekting IRF5 regulerings veje og identificerer upstream-regulatorer og pathway-komponenter. Denne undersøgelse giver en robust og pålidelig biokemisk analyse for de tidlige aktiveringshændelser af IRF5, der kan udføres i laboratorier udstyret med molekylærbiologiske værktøjer. Den protokol, der er beskrevet her, vil være meget nyttig til at undersøge veje og mekanismer for IRF5 handlinger, især når de kombineres med ortogonale analyser såsom billedbehandlings strømmen cytometrisk analyse af IRF5 nuklear lokalisering23, 27,28,30.
Native polyacrylamid gel elektroforese (native Page) er en meget anvendt metode til at analysere protein komplekser31,32. I modsætning til natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side), Native side adskiller proteiner på grundlag af deres form, størrelse, og ladning. Det bevarer også indfødte protein struktur uden denaturering31,33,34,35. Protokollen præsenteres udnytter disse funktioner i native side og registrerer både mono og dikemeje former for IRF5. Denne metode er særlig vigtig for at opdage tidlige aktiveringshændelser, fordi der ikke er noget egnet kommercielt tilgængeligt antistof, der kan detektere endogene fosforylerede IRF5. Tidligere, flere offentliggjorte undersøgelser brugt Native PAGE til at vurdere IRF5 dimerization. Størstedelen af disse undersøgelser afhang imidlertid af overekspression af eksogene epitope-mærkede IRF5 for at analysere aktiveringsstatus2,13,24,36,37 . Dette arbejde præsenterer en trin-for-trin-protokol til at analysere endogene IRF5 denne via en modificeret Native side teknik i en human plasmacytoid dendritiske Cell (pDC) linje, hvor IRF5 aktivitet har vist sig at være afgørende for sin funktion1, 38,39,40. Denne samme teknik er blevet anvendt til andre cellelinjer23.
Protokollen er beskrevet her er en modificeret Native side, der adskiller både monomeriske og dikemeje former for endogene IRF5. Der har været få undersøgelser rapporterer påvisning af endogene IRF5 aktivering ved hjælp af specialiserede Imaging flow flowcytometri teknik23,27,28,30. Denne protokol anvender en fælles teknik og almindelige reagenser og værktøjer til at vurdere den endoge…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet af finansiering fra Croucher Foundation og City University Startup fonde. Vi takker alle medlemmer af Chow-laboratoriet for at få hjælp til eksperimentet og den kritiske læsning af manuskriptet.
2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |