Inheemse polyacrylamidegel elektroforese immunoblot analyse van endogene IRF5 Dimerization
Summary
Een native Western Blot-methode voor het analyseren van endogene interferon regulatoire factor 5 door dimerisatie in de CAL-1 plasmacytoïde dendritische cellijn wordt beschreven. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere cellijnen.
Abstract
Interferon regulerend factor 5 (IRF5) is een belangrijke transcriptiefactor voor het reguleren van de immuunrespons. Het is stroomafwaarts van de tol-achtige receptor myeloïde differentiatie primaire reactie Gene 88 (TLR-MyD88) signalering traject. IRF5 activering omvat fosforylering, dimerization, en daaropvolgende translocatie van het cytoplasma in de Nucleus, die op zijn beurt induceert de genexpressie van verschillende pro-inflammatoire cytokines. Een detectie test voor IRF5 activatie is essentieel voor het bestuderen van IRF5 functies en de bijbehorende trajecten. Dit artikel beschrijft een robuuste assay voor het detecteren van endogene IRF5 activering in de CAL-1 Human plasmacytoid dendritische Cell (pDC) regel. Het protocol bestaat uit een gemodificeerde nondenaturerende elektroforese test die IRF5 kan onderscheiden in zijn monomeer en dimeer vormen, waardoor een betaalbare en gevoelige aanpak wordt geboden om IRF5 activatie te analyseren.
Introduction
Interferon Regulatory factor 5 (IRF5) is een belangrijke transcriptie regulator die een prominente rol speelt bij het reguleren van de immuunrespons, met name bij de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen en type I-interferonen (IFNs)1,2 ,3. Misregulatie van IRF5 is een bijdragende factor in talrijke auto-immuunziekten, zoals blijkt uit verschillende polymorfismen in de IRF5 Locus die geassocieerd zijn met systemische lupus erythematosus, multiple sclerose, reumatoïde artritis, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Daarom is een robuuste detectie test voor endogene IRF5 activeringsstatus cruciaal voor het begrijpen van de regelgevings trajecten en downstream-effecten van IRF5 in een fysiologisch relevante cellulaire context.
IRF5 wordt constitutief uitgedrukt in monocyten, dendritische cellen (Dc’s), B-cellen en macrofagen1,11. Net als bij andere IRF familie transcriptiefactoren, IRF5 verblijft in het cytoplasma in zijn latente toestand. Na activering, IRF5 is fosforyleerd en vormt homodimers, die vervolgens translocate in de Nucleus en binden aan specifieke regelgevende elementen van genen coderen type I IFNs en pro-inflammatoire cytokines, uiteindelijk induceren van de uitdrukking van deze genen1 ,2,11,12,13. IRF5 regelt de aangeboren immuunresponsen stroomafwaarts van verschillende tolachtige receptoren (tlrs), zoals TLR7, TLR 8, en TLR 9, die zijn gelokaliseerd in endosomes en gebruik MyD88 voor signalering1,11,14. Deze tlr’s herkennen voornamelijk vreemde nucleïnezuur soorten zoals enkelvoudig-streng RNA (ssrna) en niet-gemethyleerd CPG-DNA dat symptomatisch is voor een infectie15,16,17,18. IRF5 is aangetoond dat het reguleren van immuunresponsen tegen bacteriële, virale, en schimmelinfecties19,20,21. Gezien IRF5’s invloedrijke en diverse rol in het immuunsysteem, verbetering of demping IRF5 activiteit kan dienen als een roman Avenue voor de ontwikkeling van therapeutische agenten22. Daarom is het van cruciaal belang om een protocol te ontwikkelen om de activeringsstatus van endogene IRF5 te bewaken, om grondig onderzoek te kunnen doen naar de trajecten en mechanismen die IRF5 activiteit in verschillende celtypen reguleren.
Naar beste weten is er geen biochemische of gel-elektrofortische test voor endogene IRF5-activering gepubliceerd voorafgaand aan de ontwikkeling van dit protocol. Fosforylering is aangetoond als een belangrijke eerste stap van IRF5 activatie, en een fosfospecifieke IRF5 antilichaam werd ontwikkeld dat leidde tot de ontdekking en bevestiging van een serine residu belangrijk voor IRF5 activiteit13. Terwijl het antilichaam echter duidelijk fosforyleerd IRF5 detecteert bij immunoprecipitated of overexpressie23, het niet detecteert IRF5 fosforylering in een hele cel lysaat in onze handen (gegevens niet weergegeven). Dimerization is de volgende stap van IRF5 activatie, en vele belangrijke studies tot nu toe het onderzoeken van deze stap was gebaseerd op overexpressie van epitope-Tagged IRF5, vaak in irrelevante celtypen die normaalgesproken niet uitdrukken IRF511,12 ,24,25. Eerdere studies hebben aangetoond dat dimerized IRF5 niet altijd kan translokaliseren in de Nucleus en dus niet noodzakelijkerwijs volledig geactiveerd25,26. Een test voor endogene IRF5 nucleaire lokalisatie werd ontwikkeld om IRF5 activering te beoordelen door Imaging flow flowcytometrieonderzoeken27. Deze test is toegepast in studies die cruciaal waren voor het begrijpen van IRF5 activiteit, vooral in primaire of zeldzame celtypen28,29 en sterk gevorderd de kennis in het veld. Deze test is echter gebaseerd op een gespecialiseerd instrument dat niet algemeen beschikbaar is voor onderzoekers. Verder is het vaak nodig om de initiële stappen van activering te onderzoeken terwijl het ontleden van IRF5 regelgevings trajecten en het identificeren van upstream regulators en traject componenten. Deze studie biedt een robuuste en betrouwbare biochemische test voor de vroege activeringsgebeurtenissen van IRF5 die kunnen worden uitgevoerd in laboratoria die zijn uitgerust met moleculaire biologie tools. Het hier beschreven protocol zal zeer nuttig zijn bij het onderzoeken van de trajecten en mechanismen van IRF5 acties, vooral in combinatie met orthogonale assays zoals de beeldvormings stroom cytometrische analyse van IRF5 nucleaire lokalisatie23, 27,28,30.
Inheemse polyacrylamidegel elektroforese (native page) is een veelgebruikte methode voor het analyseren van eiwitcomplexen31,32. In tegenstelling tot natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) scheidt inheemse pagina eiwitten op basis van hun vorm, grootte en lading. Het behoudt ook inheemse eiwitstructuur zonder denaturatie31,33,34,35. Het protocol gepresenteerd maakt gebruik van deze functies van de inheemse pagina en detecteert zowel monomere en dimeer vormen van IRF5. Deze methode is vooral belangrijk voor het opsporen van vroege activeringsgebeurtenissen, omdat er geen geschikte commercieel beschikbare antilichamen zijn die endogene fosforyleerd IRF5 kunnen detecteren. Eerder, verschillende gepubliceerde studies gebruikt inheemse pagina om te beoordelen IRF5 dimerization. De meerderheid van deze studies hing echter af van de overexpressie van exogene epitope-Tagged IRF5 om de activeringsstatus te analyseren2,13,24,36,37 . Dit werk presenteert een stap-voor-stap protocol voor het analyseren van endogene IRF5 door dimerisatie via een gemodificeerde inheemse pagina techniek in een menselijke plasmacytoïde dendritische cel (pDC) lijn, waar IRF5 activiteit is aangetoond dat cruciaal zijn voor zijn functie1, 38,39,40. Deze zelfde techniek is toegepast op andere cellijnen23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschreven hier is een gemodificeerde inheemse pagina die zowel monomere en dimeer vormen van endogene IRF5 onderscheidt. Er zijn weinig studies die melden van de detectie van endogene IRF5 activering met behulp van de gespecialiseerde Imaging flow cytometrie techniek23,27,28,30. Dit protocol maakt gebruik van een veelgebruikte techniek en gebruikte reagentia en hulpmiddelen om de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door de financiering van de Croucher Foundation en de Startup fondsen van de City University. We danken alle leden van het Chow Laboratory voor hulp bij het experiment en het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
References
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O’Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios – Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochimie. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
