Native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Immunoblot-Analyse der endogenen IRF5-Dimerisierung

Published: October 06, 2019

doi:

Meijun Wang, King Hoo Lim, Kwan Ting Chow

¹Department of Biomedical Sciences,City University of Hong Kong

Summary

Eine native Western Blot-Methode zur Analyse der endogenen Interferon-Regulierungsfaktor 5-Dimerisierung in der CAL-1-Plasmazytoid-Dendritischen Zelllinie wird beschrieben. Dieses Protokoll kann auch auf andere Zelllinien angewendet werden.

Abstract

Interferon-Regulierungsfaktor 5 (IRF5) ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die Regulierung der Immunantwort. Es wird nach dem Signalweg des toll-ähnlichen Rezeptor-Myeloiden-Differenzierungsgens 88 (TLR-MyD88) aktiviert. Die IRF5-Aktivierung beinhaltet Phosphorylierung, Dimerisierung und nachfolgende Translokation vom Zytoplasma in den Zellkern, was wiederum die Genexpression verschiedener pro-inflammatorischer Zytokine induziert. Ein Nachweistest für die IRF5-Aktivierung ist für die Untersuchung von IRF5-Funktionen und deren relevanten Wegen unerlässlich. Dieser Artikel beschreibt einen robusten Test zum Nachweis der endogene IRF5-Aktivierung in der CAL-1-Linie der humanen Plasmazytoid-Dendritischen Zelle (pDC). Das Protokoll besteht aus einem modifizierten nicht denatorischen Elektrophorese-Assay, der IRF5 in seiner Monomer- und Dimerform unterscheiden kann und somit einen erschwinglichen und sensiblen Ansatz zur Analyse der IRF5-Aktivierung bietet.

Introduction

Interferon-Regulierungsfaktor 5 (IRF5) ist ein wichtiger Transkriptionsregulator, der eine herausragende Rolle bei der Regulierung der Immunantwort spielt, insbesondere bei der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und Typ-I-Interferonen (IFNs)¹^,² ^,³. Die Fehlregulation von IRF5 ist ein Faktor bei zahlreichen Autoimmunerkrankungen, wie verschiedene Polymorphismen im IRF5-Lokus zeigen, die mit systemischem Lupus erythematodes, Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis usw. assoziiert sind.⁴^, ⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. Daher ist ein robuster Nachweis-Test für den endogenen IRF5-Aktivierungszustand entscheidend für das Verständnis der regulatorischen Pfade und nachgelagerten Wirkungen von IRF5 in einem physiologisch relevanten zellulären Kontext.

IRF5 wird konstitutiv in Monozyten, dendritischen Zellen (DCs), B-Zellen und Makrophagen¹^,¹¹ausgedrückt. Wie bei anderen Transkriptionsfaktoren der IRF-Familie befindet sich IRF5 im Zytoplasma in seinem latenten Zustand. Bei aktivierung wird IRF5 phosphoryliert und bildet Homodimere, die sich dann in den Kern transortieren und an spezifische regulatorische Elemente von Genen binden, die Typ I IFNs und pro-inflammatorische Zytokine kodieren, was schließlich die Expression dieser Gene induzieren¹ ^,²^,¹¹^,¹²^,¹³. IRF5 reguliert die angeborenen Immunantworten stromabwärts von verschiedenen tollähnlichen Rezeptoren (TLRs), wie TLR7, TLR 8 und TLR 9, die in Endosomen lokalisiert sind und MyD88 für die Signalisierung¹^,¹¹^,¹⁴verwenden. Diese TLRs erkennen in erster Linie fremde Nukleinsäurearten wie einsträngige RNA (ssRNA) und unmethylierte CpG-DNA, die symptomatisch für eine Infektion¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸sind. IRF5 hat gezeigt, dass Immunreaktionen gegen bakterielle, virale, und Pilzinfektionen regulieren¹⁹^,²⁰^,²¹. Angesichts der einflussreichen und vielfältigen Rolle von IRF5 im Immunsystem könnte die Verbesserung oder Dämpfung der IRF5-Aktivität als neuer Weg für die Entwicklung von therapeutischen Wirkstoffen dienen²². Daher ist es wichtig, ein Protokoll zur Überwachung des Aktivierungsstatus des endogenen IRF5 zu entwickeln, um eine gründliche Untersuchung der Wege und Mechanismen zur Regulierung der IRF5-Aktivität in verschiedenen Zelltypen zu ermöglichen.

Nach bestem Wissen und Gewissen wurde vor der Entwicklung dieses Protokolls kein biochemischer oder gelelektrophoretischer Assay zur endogenen IRF5-Aktivierung veröffentlicht. Die Phosphorylierung hat sich als wichtiger erster Schritt der IRF5-Aktivierung erwiesen, und es wurde ein phosphospezifischer IRF5-Antikörper entwickelt, der zur Entdeckung und Bestätigung eines für die IRF5-Aktivität wichtigen Serinrückstands führte¹³. Während der Antikörper jedoch deutlich phosphoryliertes IRF5 erkennt, wenn er immunpräzipiert oder überexprimiert^{23 ist,}kann er die IRF5-Phosphorylierung in einem ganzen Zelllysat in unseren Händen nicht erkennen (Daten werden nicht angezeigt). Dimerisierung ist der nächste Schritt der IRF5-Aktivierung, und viele wichtige Studien, die diesen Schritt bisher untersuchten, stützten sich auf die Überexpression von IRF5 mit Epitop-Tag, oft in irrelevanten Zelltypen, die normalerweise Nicht IRF5¹¹^,¹² ^{ausdrücken. ,}²⁴^,²⁵. Frühere Studien haben gezeigt, dass dimerisierte IRF5 kann nicht immer in den Kern translosien und ist daher nicht unbedingt voll aktiviert²⁵^,²⁶. Ein Test für die endogene IRF5-Kernlokalisierung wurde entwickelt, um die IRF5-Aktivierung durch bildgebende Durchflusszytometrie²⁷zu bewerten. Dieser Test wurde in Studien angewendet, die für das Verständnis der IRF5-Aktivität entscheidend waren, insbesondere bei primären oder seltenen Zelltypen^28,²⁹ und das Wissen auf diesem Gebiet stark weiterentwickelt. Dieser Test stützt sich jedoch auf ein spezialisiertes Instrument, das forschern nicht allgemein zugänglich ist. Darüber hinaus ist es häufig notwendig, die ersten Schritte der Aktivierung zu untersuchen, während die IRF5-Regulierungspfade seziert und vorgeschaltete Regulierungs- und Signalwegkomponenten identifiziert werden. Diese Studie bietet einen robusten und zuverlässigen biochemischen Test für die frühen Aktivierungsereignisse von IRF5, der in Laboren durchgeführt werden kann, die mit molekularbiologischen Werkzeugen ausgestattet sind. Das hier beschriebene Protokoll wird sehr nützlich sein, um die Wege und Mechanismen von IRF5-Aktionen zu untersuchen, insbesondere in Kombination mit orthogonalen Assays wie der zytometrischen Analyse des bildgebenden Durchflusses der IRF5-Kernlokalisierung²³^, ²⁷^,²⁸^,³⁰.

Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (native PAGE) ist eine weit verbreitete Methode zur Analyse von Proteinkomplexen³¹^,³². Im Gegensatz zur Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) trennt native PAGE Proteine anhand ihrer Form, Größe und Ladung. Es behält auch native Proteinstruktur ohne Denaturierung³¹^,³³^,³⁴^,³⁵. Das vorgestellte Protokoll nutzt diese Funktionen der nativen PAGE und erkennt sowohl monomere als auch dimerische Formen von IRF5. Diese Methode ist besonders wichtig für die Erkennung von Frühaktivierungsereignissen, da es keinen geeigneten handelsüblichen Antikörper gibt, der endogene phosphorylierte IRF5 detektieren kann. Zuvor wurden in mehreren veröffentlichten Studien native PAGE verwendet, um die IRF5-Dimerisierung zu bewerten. Die meisten dieser Studien hingen jedoch von der Überexpression von exogenem Epitop mit IRF5-Tags ab, um den Aktivierungsstatus²^,¹³,²⁴^,³⁶^,^{37 zu analysieren.}. Diese Arbeit stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Analyse der endogenen IRF5-Dimerisierung über eine modifizierte native PAGE-Technik in einer menschlichen Plasmazytoid-Dendritischen Zelle (pDC) dar, bei der sich die IRF5-Aktivität als entscheidend für ihre Funktion erwiesen hat¹^, ³⁸^,³⁹^,⁴⁰. Dieselbe Technik wurde auch auf andere Zelllinien^{angewendet 23}.

Protocol

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll verwendet CAL-1 pDC-Zelllinie, die mit resiquimod (R848), einem Agonisten für TLR7/8, behandelt wird. Dieses Protokoll wurde auf andere menschliche und murine Zelltypen angewendet, einschließlich RAW 264.7 (murine Makrophagenlinie), THP-1 (menschliche monozytäre Zelllinie), BJAB (menschliche B-Zelllinie), Ramos (menschliche B-Zelllinie) und MUTZ-3 (menschliche dendritische Zelllinie)23. 1. Stimulation von CAL-1-…

Representative Results

Der Immunoblot (IB) mit einem Anti-IRF5-Antikörper wurde an CAL-1-Zellen durchgeführt, die unstimuliert oder stimuliert wurden mit 1 g/ml R848 für 2 h(Abbildung 1). Zelllysate wurden vorbereitet, und die native PAGE wurde durchgeführt. In nicht stimulierten CAL-1-Zellen wurde IRF5 als einzelnes Band auf der nativen PAGE nachgewiesen, entsprechend seiner monomeren Form. Bei der Behandlung von CAL-1-Zellen mit R848 für 2 h verringerte sich der Gehalt an IRF5-Monomer mit einer gleichzeitig…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ist eine modifizierte native PAGE, die sowohl monomische als auch dimerische Formen endogener IRF5 unterscheidet. Es gab nur wenige Studien, die über den Nachweis der endogenen IRF5-Aktivierung mit der spezialisierten Bildflusszytometrietechnik²³^,²⁷^,²⁸^,³⁰berichteten. Dieses Protokoll verwendet eine gängige Technik und gängige Reagenzien und Werkzeuge, um den e…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit wurde durch Fördermittel der Croucher Foundation und der Startup-Fonds der City University unterstützt. Wir danken allen Mitgliedern des Chow-Labors für die Hilfe beim Experiment und der kritischen Lektüre des Manuskripts.

Materials

2-Mercaptoethanol	Life Technologies, HK	21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC	Life Technologies, HK	PS0301
Anti-IRF5 antibody	Bethyl Laboratories, USA	A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe)	EcoLife, HK	MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL	Life Technologies	15575020
Glycerol 500 mL	Life Technologies	15514011
Glycine	Life Technologies, HK	15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody	LAB-A-PORTER/Rockland, HK	610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody	LAB-A-PORTER/Rockland, HK	611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x)	Thermo Fisher Scientific, HK	78430
HEPES	Life Technologies, HK	15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)	Gene Company, HK	927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories	Life Technologies, HK	NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit	Life Technologies, HK	BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x	Life Technologies, HK	BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x	Life Technologies, HK	BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol	Tin Hang/Calbiochem, HK	#492016-100ML
PBS 7.4	Life Technologies, HK	10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Bio-gene/Merck Millipore, HK	IPFL00010
Protein assay kit II (BSA)	Bio-Rad, HK	5000002
R848	Invivogen, HK	tlrl-r848
RPMI 1640	Life Technologies, HK	61870127
Sodium Chloride	ThermoFisher	BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration)	Tin Hang/Sigma, HK	D6750-100G
Tris	Life Technologies, HK	15504020
TWEEN 20	Tin Hang/Sigma, HK	#P9416-100ML

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Citer Cet Article

Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).