מקורי פוליאקרילאמיד ג'ל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני IRF5 דימרזציה
Summary
שיטת כתמי האבן המערבית המקומית לניתוח מקדם אינטרפרון הרגולציה האנדוגניים מהווה 5 דימרזציה בשורת התא הדנדריאיד של CAL-1 מתוארת. ניתן להחיל פרוטוקול זה גם על קווי תאים אחרים.
Abstract
אינטרפרון פקטור 5 (IRF5) הוא גורם שעתוק מפתח לוויסות התגובה החיסונית. הוא מופעל במורד במורד הזרם של שיחת כמו מיאלואידית קולטן מיאלואיד התגובה הראשונית גן 88 (TLR-MyD88) איתות מסלול. ההפעלה IRF5 כרוכה זירחון, דימרזציה, והטרנסלוקציה הבאים מן הציטופלסמה לתוך הגרעין, אשר בתורו מעורר את הביטוי הגנטי של ציטוקינים פרו דלקתיים שונים. שיטת זיהוי עבור הפעלת IRF5 חיונית ללימוד פונקציות IRF5 ומסלולים רלוונטיים. מאמר זה מתאר את הערך החזק לזיהוי הפעלה IRF5 אנדודוגני ב-CAL-1 (pDC) של תא הדנדריטי האנושי. הפרוטוקול מורכב מתוך שונה מבחינה אלקטרופורזה בלתי מבוקר שיכול להבחין IRF5 בצורות המונומר שלה דיימר, ובכך לספק גישה במחיר סביר ורגיש לנתח IRF5 הפעלה.
Introduction
אינטרפרון התקינה פקטור 5 (IRF5) הוא מווסת שעתוק חשוב המשחק תפקיד בולט בוויסות התגובה החיסונית, במיוחד לשחרור ציטוקינים פרו דלקתיים וסוג אני הפרעות (ifns)1,2 ,3. Misregulation של IRF5 הוא גורם תורם במחלות אוטואימוניות רבות, כפי שניכר על ידי פולימריות שונות ב IRF5 לוקוס כי הם קשורים עם זאבת מערכתית אריתסוס, טרשת נפוצה, דלקת מפרקים שגרונית, וכו ‘4, . חמש,שש,שבע,שמונה,9,10 לכן, שיטת גילוי חזקה עבור מצב הפעלה אנדודוגני IRF5 היא חיונית להבנת מסלולים הרגולציה ואת ההשפעה של הזרם של IRF5 בהקשר הסלולר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית.
IRF5 הוא מבוטא באופן קונסטיטולי ב מונוציטים, תאים דנדריטים (DCs), B תאים, ו מקרופאגים1,11. כמו בשאר משפחת IRF מרכיבי התעתיק, IRF5 שוכנת בציטופלסמה במצבו הנסתר. עם ההפעלה, IRF5 הוא זרחנות וצורות הומודימרס, אשר לאחר מכן העברה לתוך הגרעין ולאגד אלמנטים הרגולציה ספציפיים של גנים קידוד סוג I IFNs והפרו-דלקתיות ציטוקינים, בסופו של דבר גרימת הביטוי של גנים אלה1 ,2,11,12,13. IRF5 מווסת את התגובות החיסוניות המורמות במורד של קולטני שונים כמו שיחות (tlrs), כגון TLR7, tlrs 8, ו-tlrs 9, אשר מותאמים לאנזומים ומשתמשים ב-MyD88 עבור איתות1,11,14. אלה tlrs לזהות בעיקר חומצות גרעין זרות מינים כגון רנ א אחד (ssrna) ו-DNA הסרת מתילated של ה-CpG כי הם סימפטומים של זיהום15,16,17,18. IRF5 הוכח לווסת את התגובות החיסונית נגד חיידקים, נגיפי, ופטריות זיהומים19,20,21. בהתחשב IRF5’s תפקיד המשפיע והמגוונים במערכת החיסונית, שיפור או לחות פעילות IRF5 יכול לשמש כשדרה הרומן לפיתוח של סוכנים טיפוליים22. מכאן, זה קריטי לפתח פרוטוקול כדי לפקח על מצב ההפעלה של אנדודוגני IRF5 כדי לאפשר חקירה יסודית של מסלולים ומנגנונים המסדירים פעילות IRF5 סוגי תאים שונים.
למיטב הידע שלנו, לא שיטת ביוכימיה או ג’ל אלקטרופלטית עבור הפעלה אנדודוגני IRF5 פורסמה לפני הפיתוח של פרוטוקול זה. זירחון הוכח להיות צעד ראשון חשוב של הפעלה IRF5, והנוגדן IRF5 מסוים זרחן פותחה כי הוביל גילוי ואישור של סרין שאריות חשוב עבור IRF5 פעילות13. עם זאת, בעוד הנוגדן מזהה בבירור IRF5 זרחתי כאשר immunoprecipitated או overexpressed יטא23, זה לא מצליח לזהות IRF5 זרחון בתאים שלמים בידינו (נתונים לא מוצגים). דימרזציה היא השלב הבא של IRF5 הפעלה, ומחקרים חשובים רבים עד כה בחקירת שלב זה הסתמך על ביטוי יתר של אפירופה-מתויג IRF5, לעתים קרובות בסוגי תאים לא רלוונטיים שאינם מבטאים בדרך כלל IRF511,12 ,24,25. מחקרים קודמים הראו כי dimerized IRF5 לא תמיד לאתר את הגרעין ולכן הוא לא בהכרח הופעל באופן מלא25,26. שיטת התאמה לוקליזציה גרעינית IRF5 פותחה כדי להעריך את IRF5 ההפעלה על ידי זרימת הדמיה cy try27. השיקול הזה הוחל במחקרים שהיו חיוניים להבנת פעילות IRF5, במיוחד בסוגי תאים ראשוניים או נדירים28,29 , ומתקדם מאוד את הידע בתחום. עם זאת, שיטת הפעולה נשענת על כלי מיוחד שאינו זמין באופן נרחב לחוקרים. יתר על כן, לעתים קרובות יש צורך לחקור את הצעדים הראשוניים של ההפעלה תוך מנתח מסלולים IRF5 רגולציה וזיהוי הרגולטורים במעלה ורכיבי מסלול. מחקר זה מספק שיטת ביוכימית איתנה ואמינה לאירועי ההפעלה המוקדמים של IRF5 שניתן לבצע במעבדות המצוידות בכלים ביולוגיים מולקולריים. הפרוטוקול המתואר כאן יהיה שימושי מאוד בחקירת מסלולים ומנגנונים של פעולות IRF5, במיוחד כאשר בשילוב עם אורתוגונאליות מספר כגון הדמיה של זרימת ההדמיה ניתוח ציטוטומטשל IRF5 לוקליזציה גרעינית23, 27,28,30.
פוליאקרילמיד ג’ל אלקטרופורזה (עמוד מקורי) היא שיטה נפוצה לניתוח מתחמי חלבונים31,32. בניגוד נתרן dodecylsulfate אלקטרופורזה ג’ל אלקטרופורזה (sds-page), דף יליד מפריד חלבונים על בסיס צורתם, גודל, וטעינה. זה גם שומרמבנה החלבון המקוריללא הדציה31,33,34,35. הפרוטוקול המוצג מנצל תכונות אלה של דף מקורי ומזהה הן monomeric ו dimeric צורות של IRF5. שיטה זו חשובה במיוחד לגילוי אירועים הפעלה מוקדמת, כי אין נוגדן המתאים מסחרית זמין שיכול לזהות זרחני IRF5. בעבר, מספר מחקרים שפורסמו השתמשו בעמוד יליד כדי להעריך IRF5 dimerization. עם זאת, רוב המחקרים תלויים בביטוי יתר של אפידוגני-מתויג IRF5 לנתח מצב הפעלה2,13,24,36,37 . עבודה זו מציגה פרוטוקול צעד אחר צעד לניתוח אנדוגניים IRF5 dimerization באמצעות שינוי בטכניקה מקורית של דף מקורי (pDC) האדם תא דנדריטי, שם הפעילות IRF5 הוכח קריטי עבור תפקידה1, 38,39,40. אותה טכניקה הוחלה על קווי תאים אחרים23.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן הוא דף יליד שונה אשר מבדיל הן monomeric ו dimeric צורות של אנדודוגני IRF5. היו מחקרים מעטים דיווחו על זיהוי של הפעלה אנדודוגני IRF5 באמצעות זרימת הדמיה מיוחדות cy, 27,25,28,30. פרוטוקול זה משתמש בטכניקה נפוצה וריאגנט?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי מימון של קרן קראוצ’ר וקרנות האתחול של אוניברסיטת סיטי. אנו מודים לכל חברי המעבדה צ’או לקבלת עזרה בניסוי ובקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
References
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O’Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios – Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochimie. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
