内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析
Summary
CAL-1血漿細胞性樹状細胞株における内因性インターフェロン調節因子5ダイアライゼーションを分析するためのネイティブウェスタンブロット法が記載されている。このプロトコルは、他のセルラインにも適用できます。
Abstract
インターフェロン調節因子5(IRF5)は、免疫応答を調節するための重要な転写因子である。トール様受容体ミエロイド分化一次応答遺伝子88(TLR-MyD88)シグナル伝達経路の下流で活性化される。IRF5活性化は、細胞質から核へのリン酸化、ダイマライゼーション、およびその後の転移を伴い、様々な炎症性サイトカインの遺伝子発現を誘導する。IRF5活性化のための検出アッセイは、IRF5関数とその関連経路を研究するために不可欠です。本論文では、CAL-1ヒト血漿細胞系樹状細胞(pDC)ラインにおける内因性IRF5活性化を検出する堅牢なアッセイについて説明する。このプロトコルは、モノマーおよびダイマーの形でIRF5を区別できる改変された非脱電性電気泳動アッセイで構成されており、IRF5活性化を分析するための手頃な価格で敏感なアプローチを提供します。
Introduction
インターフェロン調節因子5(IRF5)は、特に炎症性サイトカインおよびI型インターフェロン(IFN)1、2の放出において、免疫応答を調節する上で顕著な役割を果たす重要な転写調節因子である。 、3.IRF5の誤認は、全身性エリテマトース、多発性硬化症、関節リウマチなどに関連するIRF5遺伝子座の様々な多型によって明らかなように、多数の自己免疫疾患の一因である4、5,6,7,8,9,10.したがって、内因性IRF5活性化状態に対する堅牢な検出アッセイは、生理学的に関連する細胞コンテキストにおけるIRF5の調節経路および下流効果を理解するために重要である。
IRF5は、単球、樹状細胞(DC)、B細胞、およびマクロファージ1、11で構成的に発現される。他のIRFファミリー転写因子と同様に、IRF5は潜伏状態の細胞質に存在する。活性化すると、IRF5はリン酸化され、ホモダイマーを形成し、その後核に転移し、I型IFNおよび炎症性サイトカインをコードする遺伝子の特定の調節要素に結合し、最終的にこれらの遺伝子1の発現を誘導する。 ,2,11,12,13.IRF5は、エンドソームに局在するTLR7、TLR8、およびTLR9などの様々なトール様受容体(TLR)の下流の自然免疫応答を調節し、シグナル伝達1、11、14にMyD88を使用する。これらのTTLは、主に感染15、16、17、18の症状である一本鎖RNA(ssRNA)および非メチル化CpG DNAなどの外来核酸種を認識する。IRF5は、細菌、ウイルス、および真菌感染症19、20、21に対する免疫応答を調節することが示されている。免疫系におけるIRF5の影響力と多様な役割を考えると、IRF5活性を増強または減衰させることは、治療薬22の開発のための新しい道として役立つ可能性がある。したがって、異なる細胞型におけるIRF5活性を調節する経路およびメカニズムを徹底的に調査できるように、内因性IRF5の活性化状態を監視するプロトコルを開発することが重要である。
我々の知る限りでは、このプロトコルの開発前に、内因性IRF5活性化のための生化学的またはゲル電気泳動アッセイは公表されていない。リン酸化は、IRF5活性化の重要な第一歩であることが示されており、IRF5活性13にとって重要なセリン残基の発見と確認につながったリン特異的IRF5抗体が開発された。しかし、抗体は、免疫沈殿または過剰発現時にリン酸化IRF5を明確に検出する一方で、我々の手の中の全細胞リサートにおけるIRF5リン酸化を検出することができない(データは示されていない)。二量体化はIRF5活性化の次のステップであり、このステップを調査する多くの重要な研究は、通常IRF511、12を発現しない無関係な細胞型において、エピトープタグ付きIRF5の過剰発現に依存していた。、24、25。これまでの研究では、二分化されたIRF5が必ずしも核に転移するとは限らないため、必ずしも完全に活性化されるとは限らないことが示されている。内因性IRF5核局在化のためのアッセイは、イメージングフローサイトメトリー27によるIRF5活性化を評価するために開発された。このアッセイは、特に一次細胞型28、29型においてIRF5活性を理解するために重要な研究に適用され、分野の知識を大幅に進歩させた。しかし、このアッセイは、研究者が広く利用できない特殊な機器に依存しています。さらに、IRF5規制経路を解剖し、上流のレギュレータおよび経路成分を同定しながら、活性化の初期段階を調査する必要が生じることがよくあります。本研究は、分子生物学ツールを搭載したラボで行うことができるIRF5の初期活性化イベントに対して、堅牢で信頼性の高い生化学的アッセイを提供します。ここで説明するプロトコルは、特にIRF5核局在化23のイメージングフローサイトメトリック解析などの直交アッセイと組み合わせると、IRF5作用の経路とメカニズムを調べるのに非常に役立ちます。27,28,30.
天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ネイティブPAGE)は、タンパク質複合体31、32を分析するために広く使用されている方法である。ドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動ナトリウムとは異なり、ネイティブPAGEは、その形状、サイズ、および電荷に基づいてタンパク質を分離します。また、退化31、33、34、35なしでネイティブタンパク質構造を保持します。提示されたプロトコルは、ネイティブPAGEのこれらの機能を利用し、IRF5のモノマーとダイメリックの両方の形式を検出します。この方法は、内因性リン酸化IRF5を検出できる適切な市販の抗体がないため、早期活性化事象を検出するために特に重要である。以前は、いくつかの公開された研究では、ネイティブ PAGE を使用して IRF5 ダイアライゼーションを評価していました。しかし、これらの研究の大半は、活性化状態2、13、24、36、37を分析するために外因性エピトープタグ付きIRF5の過剰発現に依存していました.本研究は、ヒト血漿細胞細胞系樹状細胞(pDC)ラインにおける改変されたネイティブPAGE技術を介して内因性IRF5ダイアライゼーションを解析するためのステップバイステッププロトコルを提示し、そこでIRF5活性がその機能1に重要であることが示された。 38、39、40。この同じ技術は、他の細胞株23に適用されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、内因性IRF5のモノマーと薄暗の両方の形態を区別する修正されたネイティブPAGEです。特殊なイメージングフローサイトメトリー技術23、27、28、30を用いて内因性IRF5活性化の検出を報告する研究はほとんど行われていない。このプロトコルは、一般的な技術と一般的?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、クローチャー財団とシティ大学のスタートアップファンドからの資金援助によって支援されました。私たちは、原稿の実験と批判的な読書の助けをチャウ研究所のすべてのメンバーに感謝します。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
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