Une méthode occidentale indigène de tache pour analyser le facteur réglementaire endogène d'interféron 5 dimerization dans la ligne de cellules dendritiques plasmacytoid de CAL-1 est décrite. Ce protocole peut également être appliqué à d'autres lignées cellulaires.
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Article de méthode
Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analyse de la dimérisation Endogenous IRF5
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le facteur de régulation de l'interféron 5 (IRF5) est un facteur de transcription clé pour réguler la réponse immunitaire. Il est activé en aval de la voie de signalisation de la différence myéloïde de récepteur de péage 88 (TLR-MyD88). L'activation d'IRF5 implique la phosphorylation, la dimerisation, et la translocation suivante du cytoplasme dans le noyau, qui à son tour induit l'expression de gène de diverses cytokines pro-inflammatoires. Un test de détection pour l'activation iRF5 est essentiel à l'étude des fonctions IRF5 et de ses voies pertinentes. Cet article décrit un analyse robuste pour détecter l'activation endogène d'IRF5 dans la ligne humaine de cellules dendritiques deplasmacytoid de CAL-1. Le protocole consiste en un analyse d'électrophorèse non dénaturante modifiée qui permet de distinguer IRF5 dans ses formes monomères et dimères, offrant ainsi une approche abordable et sensible pour analyser l'activation de l'IRF5.
Introduction
Le facteur de régulation de l'interféron 5 (IRF5) est un important régulateur de transcription qui joue un rôle de premier plan dans la régulation de la réponse immunitaire, en particulier dans la libération de cytokines pro-inflammatoires et d'interférons de type I (IFN)1,2 ,3. La mauvaise régulation de l'IRF5 est un facteur contribuant à de nombreuses maladies auto-immunes, comme en témoignent les divers polymorphismes dans le locus IRF5 qui sont associés au lupus érythémateux systémique, à la sclérose en plaques, à la polyarthrite rhumatoïde, etc.4....
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Protocole
REMARQUE: Le protocole décrit ici utilise la lignée cellulaire CAL-1 pDC traitée avec resiquimod (R848), un agoniste pour TLR7/8. Ce protocole a été appliqué à d'autres types de cellules humaines et murine, y compris RAW 264.7 (ligne de macrophage murine), THP-1 (ligne cellulaire monocytique humaine), BJAB (ligne humaine de cellules B), Ramos (ligne humaine de cellules B), et MUTZ-3 (ligne de cellules dendritiques humaines)23.
1. Stimulation des cellules CAL-1
- Maintenir les cultures cellulaires CAL-1 dans un flacon T75 à 37 oC et 5 % de CO2 dans des conditions stériles avec 20 à ....
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Résultats
L'immunoblot (IB) avec un anticorps anti-IRF5 a été réalisé sur des cellules CAL-1 non stimulées ou stimulées avec 1 g/mL R848 pour 2 h (Figure 1). Des lysates de cellules ont été préparés, et le PAGE indigène a été exécuté. Dans les cellules CAL-1 non stimulées, IRF5 a été détecté comme une seule bande sur la PAGE native, correspondant à sa forme monomérique. Sur le traitement des cellules CAL-1 avec R848 pendant 2 h, le niveau de monomère d'IRF5 a diminué avec une augmentation simultanée d.......
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Discussion
Le protocole décrit ici est un PAGE indigène modifié qui distingue les formes monomeric et dimériques de l'IRF5 endogène. Il y a eu peu d'études rapportant la détection de l'activation endogène d'IRF5 utilisant la technique spécialisée de cytométrie de flux d'imagerie23,27,28,30. Ce protocole utilise une technique commune et des réactifs et des outils communs pour évaluer l'état d'activation iD.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les travaux ont été soutenus par des fonds de la Fondation Croucher et des fonds de démarrage de l'Université de la Ville. Nous remercions tous les membres du laboratoire Chow pour leur aide dans l'expérience et la lecture critique du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| Alimentation 300 W/250 V 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anticorps anti-IRF5 | Bethyl Laboratories, États-Unis | A303-385 | |
| Biosan Rocker Shaker (sans danger pour les chambres froides) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| Tampon EDTA, pH 8, 0,5 M 4x 100 mL | Technologies | ||
| Glycérol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Anticorps conjugués anti-souris IgG DyLight 800 de chèvre | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Anticorps conjugués anti-IgG de lapin DyLight 800 | de chèvre LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Cocktail d’inhibiteurs de protéase Halt (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo ; Module de transfert, accessoires | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12 % gels, kit 10 puits | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/ Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein sey sey kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | ||
| Chlorure de sodium | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Désoxycholate de sodium &ge ; 97 % (titrage) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
Références
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that....
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Réimpressions et autorisations
