Native polyakrylamid gel elektrofores immunoblot analys av endogena IRF5 Dimerization
Summary
En Native Western blot metod för att analysera endogena interferon reglerande faktor 5 Dimerization i Cal-1 dess dendritiska cellinjer beskrivs. Detta protokoll kan även tillämpas på andra cellinjer.
Abstract
Interferon regulatorisfaktor 5 (IRF5) är en viktig transkriptionsfaktor för att reglera immunsvaret. Det aktiveras nedströms den Toll-liknande receptor myeloisk differentiering primär respons gen 88 (TLR-MyD88) signalering väg. IRF5 aktiveringen involverar fosforylering, dimerisering, och efterföljande flyttning från cytoplasman i kärnan, vilket i sin tur inducerar genuttrycket av olika pro-inflammatoriska cytokiner. En detektions analys för IRF5 aktivering är avgörande för att studera IRF5 funktioner och dess relevanta vägar. Denna artikel beskriver en robust analys för att upptäcka endogena IRF5 aktivering i Cal-1 Human dess dendritiska cell (pDC) linje. Protokollet består av en modifierad nondenaturing elektrofores assay som kan skilja IRF5 i sin monomer och dimer former, vilket ger en prisvärd och känslig metod för att analysera IRF5 aktivering.
Introduction
Interferon reglerande faktor 5 (IRF5) är en viktig transkription regulator som spelar en framträdande roll i regleringen av immunförsvaret, särskilt i frisättning av pro-inflammatoriska cytokiner och typ I interferoner (ifns)1,2 ,3. Misregulation av IRF5 är en bidragande faktor i många autoimmuna sjukdomar, som framgår av olika polymorfismer i IRF5 Locus som är förknippade med systemisk lupus erythematosus, multipel skleros, reumatoid artrit, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Därför är en robust detektions analys för endogena IRF5 aktiveringstillstånd avgörande för att förstå de reglerings vägar och nedströms effekter av IRF5 i en fysiologiskt relevant cellulära sammanhang.
IRF5 är konstitutivt uttrycks i monocyter, dendritiska celler (DCs), B-celler, och makrofager1,11. Som med andra IRF familj transkription faktorer, IRF5 bosatt i cytoplasman i dess latent tillstånd. Vid aktivering, IRF5 är fosforyleras och bildar homodimers, som sedan translocate i kärnan och binda till specifika reglerande element av gener kodning typ I IFNs och pro-inflammatoriska cytokiner, så småningom inducera uttrycket av dessa gener1 ,2,11,12,13. IRF5 reglerar de medfödda immunsvaren nedströms olika Toll-liknande receptorer (TLRs), såsom TLR7, TLR 8, och TLR 9, som är lokaliserade i hos och använda MyD88 för signalering1,11,14. Dessa TLRs erkänna främst utländska nukleinsyra arter såsom enkelsträngad RNA (ssRNA) och unmethylated CPG DNA som är symptomatiskt för en infektion15,16,17,18. IRF5 har visat sig reglera immunsvaret mot bakteriella, virala och svampinfektioner19,20,21. Med tanke på IRF5’s inflytelserika och varierande roll i immunförsvaret, förbättra eller dämpa IRF5 aktivitet skulle kunna fungera som en roman Avenue för utveckling av terapeutiska agenter22. Därför är det viktigt att utveckla ett protokoll för att övervaka aktiveringsstatusen för endogena IRF5 för att möjliggöra en grundlig utredning av de vägar och mekanismer som reglerar IRF5 aktivitet i olika celltyper.
Enligt vår vetskap har ingen biokemisk eller gel-elektroforetisk analys för endogen IRF5 aktivering publicerats före utvecklingen av detta protokoll. Fosforylering har visat sig vara ett viktigt första steg i IRF5 aktiveringen och en fosfospecifik IRF5 antikropp utvecklades som ledde till upptäckten och bekräftelsen av en serinrester viktig för IRF5 aktivitet13. Men medan antikroppen tydligt upptäcker fosforylerade IRF5 när immunoprecipitated eller överuttryckt23, det misslyckas med att upptäcka IRF5 fosforylering i en hel cell lysate i våra händer (data visas inte). Dimerization är nästa steg i IRF5 aktiveringen, och många viktiga studier hittills undersökt detta steg förlitade sig på överuttryck av Epitope-märkta IRF5, ofta i irrelevanta celltyper som normalt inte uttrycker IRF511,12 ,24,25. Tidigare studier har visat att dimerized IRF5 kanske inte alltid translocate in i kärnan och därmed är inte nödvändigtvis fullt aktiverad25,26. Ett test för endogen IRF5 nukleär lokalisering utvecklades för att bedöma IRF5 aktivering av Imaging Flow flödescytometrianalys27. Denna analys har tillämpats i studier som var avgörande för att förstå IRF5 aktivitet, särskilt i primära eller sällsynta celltyper28,29 och kraftigt avancerade kunskaper inom området. Emellertid, denna analys förlitar sig på ett specialiserat instrument som inte är allmänt tillgänglig för forskare. Vidare är det ofta nödvändigt att undersöka de första stegen för aktivering samtidigt dissekera IRF5 reglerings vägar och identifiera uppströms tillsynsmyndigheter och komponenter väg. Denna studie ger en robust och tillförlitlig biokemisk analys för tidiga aktiverings händelser av IRF5 som kan utföras i laboratorier utrustade med molekylärbiologi verktyg. Det protokoll som beskrivs här kommer att vara mycket användbart för att undersöka vägar och mekanismer för IRF5 åtgärder, särskilt i kombination med ortogonala analyser såsom Imaging Flow kors analys av IRF5 nukleär lokalisering23, 27,28,30.
Native polyakrylamid gel elektrofores (infödda sida) är en allmänt använd metod för att analysera proteinkomplex31,32. Till skillnad från natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), separerar den infödda sidan proteiner på grundval av deras form, storlek och laddning. Det behåller också inhemska proteinstruktur utan denaturering31,33,34,35. Det protokoll som presenteras utnyttjar dessa funktioner i infödda sida och upptäcker både monomeriska och dimeriska former av IRF5. Denna metod är särskilt viktig för att upptäcka tidiga aktiverings händelser eftersom det inte finns någon lämplig kommersiellt tillgänglig antikropp som kan detektera endogena fosforylerade IRF5. Tidigare, flera publicerade studier används infödda sida för att bedöma IRF5 Dimerization. Majoriteten av dessa studier berodde dock på överuttryck av exogena Epitope-märkta IRF5 att analysera aktiveringsstatus2,13,24,36,37 . Detta arbete presenterar ett steg-för-steg-protokoll för att analysera endogena IRF5 Dimerization via en modifierad infödd sida teknik i en human dess dendritiska cell (pDC) linje, där IRF5 aktivitet har visat sig vara avgörande för dess funktion1, 38,39,40. Samma teknik har tillämpats på andra cellinjer23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här är en modifierad infödd sida som skiljer både monomeriska och dimeriska former av endogena IRF5. Det har varit få studier som rapporterar upptäckten av endogena IRF5 aktivering med hjälp av specialiserade Imaging Flow flödescytometrianalys teknik23,27,28,30. Detta protokoll använder en gemensam teknik och vanliga reagenser och verktyg för att bedöma det e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av finansiering från Croucher Foundation och City University Startup Funds. Vi tackar alla medlemmar i Chow Laboratory för hjälp med experimentet och kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
References
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O’Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios – Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochimie. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
