Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie
Summary
Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.
Abstract
Invasive Lungeninfektion durch den Schimmel Aspergillus fumigatus stellt eine große Bedrohung für immungeschwächte Patienten dar. Inhalierte Pilzkonidien (Sporen) werden von den menschlichen Lungenalveolen durch angeborene Monozyten und/oder Neutrophile phagozytoisiert. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Messung der Phagozytose durch Durchflusszytometrie mit Fluorescein isothiocyanat (FITC)-markierten Conidie nativ für die Ko-Inkubation mit menschlichen Leukozyten und anschließende Gegenfärbung mit einem Anti-FITC-Antikörper, um eine Diskriminierung von internalisiertem und zellhaftem Konidien zu ermöglichen. Wesentliche Vorteile dieses Protokolls sind seine Schnelligkeit, die Möglichkeit, den Assay mit der zytometrischen Analyse anderer Zellmarker von Interesse zu kombinieren, die gleichzeitige Analyse von Monozyten und Neutrophilen aus einer einzigen Probe und seine Anwendbarkeit auf andere zellwandtragende Pilze oder Bakterien. Die Bestimmung der Prozentsätze von Phagozytosing-Leukozyten bietet Mikrobiologen ein Mittel zur Beurteilung der Virulenz eines Erregers oder zum Vergleich von Pathogenwildarten und Mutanten sowie Immunologen zur Untersuchung der Fähigkeiten menschlicher Leukozyten zur Bekämpfung von Krankheitserregern.
Introduction
Invasive lungenaspergillose ist eine große Bedrohung für immungeschwächte Patienten, da die Behandlungsmöglichkeiten begrenzt sind und erst bei einer frühen Diagnose erfolgreich sind, was zu hohen Sterblichkeitsraten führt1. Infektionserreger sind Conidia (Sporen) der Form Aspergillus fumigatus, die in den meisten Lebensräumen allgegenwärtig sind2. Conidia werden eingeatmet, passieren die Atemwege und können schließlich in die Lungenalveolen gelangen. Bei immunkompetenten Menschen werden diese Conidien durch angeborene Immunzellen wie Monozyten oder Makrophagen und neutrophile Granulozyten, die die Erreger aufnehmen (Phagozytose) aufnehmen und verdauen, gelöscht3. Phagozytose ist wichtig für Mikrobiologen und Immunologen, auch wenn sie an Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen interessiert ist. Konfrontationstests, wie die Ko-Inkubation von Leukozyten und Conidie, umfassen häufig die Kennzeichnung der Sporen durch Fluorescein oder deren Derivat Fluoresceinisothiocyanat (FITC). Mit Hilfe eines Mikroskops ist es einfach, verinnerlichte fluoreszierende Konidien zu identifizieren und angehängte/haftende Konidien zu bestimmen, obwohl dieser Ansatz umständlich und realistischerweise auf ein paar hundert Zellen beschränkt ist4. In der Durchflusszytometrie, die die Analyse von Hunderttausenden von Zellen innerhalb von Minuten leicht ermöglicht, ist jedoch eine differenzielle Färbung von phagozytosierter und anhaftender Konidie von entscheidender Bedeutung. Daher verlassen sich viele Protokolle auf Trypan Blue, um fitC-Fluoreszenz aus der anhaftenden Conidia5,6,7,8zu löschen. Ein anderer Ansatz ist die Nutzung der Fluoreszenzresonanzenergieübertragung von Ethidiumbromid und FITC, um rote statt grüne Fluoreszenz aus der anhaftenden Konidie9,10,11auszusenden. Wenn spezifische Antikörper verfügbar sind, wie dies bei einigen Bakterien der Fall ist, können zellgebundene Partikel direkt gebeizt werden12,13.
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und quantitativen Bewertung der Phagozytose von FITC-markierter A. fumigatus conidia durch menschliche Leukozyten zusammen mit der Anhaftung von Sporen an Zellen und mangelnder Wechselwirkung durch den Einsatz eines Mitwirkungsmittels (APC)-gekoppelten Anti-FITC-Antikörpers. Die Methode ermöglicht auch die gleichzeitige zytometrische Analyse weiterer Zellmarker, die für die separate Analyse der Phagozytose durch Monozyten und Neutrophilen aus derselben Probe eingesetzt werden können.
Das Protokoll kann für die Charakterisierung von Pilzstämmen (z. B. mehrere Arten von Aspergillus und anderen Schimmelpilzen aus der Gattung Mucorales, die hier vorgestellt werden) und deren Mutanten14 und immunologische Forschung an Phagozyten, wie Leukozyten von immungeschwächten Individuen, angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine zytometrische Schnelle-Flow-Methode zur Messung der Wechselwirkung von A. fumigatus conidia mit einer großen Anzahl primärer menschlicher Leukozyten dar, was in gängigen mikroskopischen Protokollen nicht möglich ist. Die Bildgebung von Zellen mit einem Mikroskop und das manuelle Zählen von internalisierter Konidie ist umständlich und kann realistischerweise nur für ein paar hundert Zellen durchgeführt werden. Durchflusszytometrie überwindet dieses Problem, indem Tausende von…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Pia Stier für die ausgezeichnete technische Unterstützung. M. von Lilienfeld-Toal wird vom Zentrum für Sepsis-Kontrolle und Pflege (Bundesministerium für Bildung und Gesundheit, BMBF, FKZ 01E01002) und dem InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D) unterstützt. Thi Ngoc Mai Hoang wird von der Jenaer Schule für Mikrobielle Kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2) unterstützt
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
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