Cet article décrit une méthode de transplantation pour greffer les cellules épithéliales mammaires de rat de distributeur dans le tampon blanc interscapular de graisse des animaux destinataires. Cette méthode peut être utilisée pour examiner les effets de l’hôte et/ou du donneur sur le développement de l’épithélium mammaire et élimine le besoin de pré-compensation, étendant ainsi l’utilité de cette technique.
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Article de méthode
Transplantation de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon blanc interscapulaire de graisse
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dès les années 1970, les chercheurs ont réussi à transplanter des cellules épithéliales mammaires dans la coussinet de graisse blanche interscapulaire des rats. La greffe de l’épithélium mammaire à l’aide de techniques de transplantation tire parti de l’environnement hormonal fourni par l’hôte rongeur adolescent. Ces études sont idéalement adaptées pour explorer l’impact de diverses manipulations biologiques sur le développement des glandes mammaires et disséquer de nombreux aspects de la biologie des glandes mammaires. Une caractéristique commune, mais limitante, est que les cellules épithéliales transplantées sont fortement influencées par le stroma environnant et surpassées en concurrence par l’épithélium endogène ; pour employer le tissu mammaire indigène, le tampon blanc abdominal-inguinal de graisse doit être dégagé pour enlever l’épithélium mammaire d’hôte avant la transplantation. Un obstacle majeur lors de l’utilisation de l’organisme modèle de rat est que le dégagement de l’arbre mammaire en développement chez les rats post-soudés n’est pas efficace. Une fois transplantées dans des garnitures sans glande, les cellules épithéliales de distributeur peuvent repeupler le tampon de graisse d’hôte dégagé et former une glande mammaire fonctionnelle. Le tampon de graisse interscapulaire est un endroit alternatif pour ces greffes. Un avantage majeur est qu’il manque de structures canalaires mais fournit le stroma normal qui est nécessaire pour favoriser la croissance épithéliale et est facilement accessible chez le rat. Un autre avantage majeur de cette technique est qu’elle est peu invasive, car elle élimine la nécessité de cautériser et d’enlever l’arbre mammaire endogène en croissance. En outre, le tampon de graisse interscapulaire contient un vaisseau sanguin médial qui peut être utilisé pour séparer les sites pour la greffe. Puisque les glandes endogènes restent intactes, cette technique peut également être employée pour des études comparant la glande mammaire endogène à la glande transplantée. Cet article décrit la méthode de la transplantation épithéliale de cellules mammaires dans le tampon blanc interscapulaire de graisse des rats.
Introduction
Le développement des glandes mammaires postnatales et la morphogénèse canalaire sont des processus largement influencés par la signalisation hormonale au début de la puberté. Chez les souris et les rats, organismes modèles couramment utilisés de la biologie des glandes mammaires, ce processus commence vers l’âge de 3 semaines, où la prolifération et la différenciation rapides entraînent la formation du parenchyme mature. La glande mammaire mature peut subir de nombreuses séries d’expansion et d’involution, une propriété qui a été à l’étude depuis le début du20e siècle. Dans le contexte de l’hyperprolifération et du développement du cancer, des techniques de....
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Protocole
Tous les animaux ont été logés et entretenus dans un établissement approuvé par l’AAALAC, et les expériences décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du MUSC. Les animaux destinés à la transplantation réciproque doivent être une souche consanguine ou isogénique, avec un statut congénique préféré ou rétrocroisé pendant au moins 6 générations.
1. Récolte de l’épithélium de la glande mammaire du rat donneur
- Déterminer le nombre de rats donneurs nécessaires à la transplantation.
REMARQUE : En général, 1 rat donneur (4 semaines) peut fournir suffisamment....
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Résultats
Glandes mammaires de donneur et de receveur
Les étapes pour isoler et préparer les cellules épithéliales mammaires de rat pour la transplantation sont montrées dans la figure 1A. À l’âge de 4 semaines, la glande mammaire endogène du rat donneur a commencé la maturation et l’épithélium peut être visualisé sur des lames montées entières tachées de carmin d’alun (Figure 1
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Discussion
Ce protocole décrit une technique de transplantation épithéliale mammaire optimisée pour travailler avec des rats. Les organoïdes épithéliales mammaires isolés des rats donneurs (3-5 semaines) sont greffés dans le coussinet de graisse blanc interscapulaire des rats receveurs (également 3-5 semaines d’âge). Les résultats peuvent être interprétés aussi peu que 4-6 semaines plus tard, en utilisant la microscopie légère pour examiner le tissu greffé; cependant, la quantité optimale de temps entre la transplantation et le sac.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été financé par le Hollings Cancer Center’s Cancer Center’s Cancer Center Support Grant P30 CA138313 financement de la recherche pilote des National Institutes of Health (https://www.nih.gov/), et des fonds du Département de pathologie et de médecine de laboratoire à l’Université médicale de Caroline du Sud. Nous tenons à remercier Marijne Smiths d’avoir enregistré les déclarations d’entrevue.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,2 et micro ; Filtres pour seringues | M Fisher Scientific | 09-715G | milieux de digestion de collagénase filtrants stériles |
| 1,5 - 2,0 mL tubes à microcentrifuger (stériles) | Fisher Scientific | 05-408-129 | contenant des cellules remises en suspension et/ou un mélange d’homogénat de cerveau |
| 100 & micro ; Filtres à cellules M | Corning | 431752 | Filtrer l’homogénat du cerveau |
| 100 uL Seringues étanches au gaz avec aiguilles de calibre 25 | Hamilton | 81001 & 90525 | Pour injecter un mélange de greffon dans des animaux receveurs (1 par génotype/condition de donneur) |
| 1000 uL pointes de pipette + pipette | -- | transfert de cellules/mélanges/tissus | |
| 15 mL Tube en polypropylène | Falcon (Corning) | 352196 | stockage du mélange d’homogénat cérébral, ou cellule : mélange d’homogénat pour la transplantation |
| 40 & micro ; Filtres à cellules | M Corning | 431750 | organoïdes filtrants après lavage de la pastille cellulaire |
| Tubes en polypropylène de 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-6 | pour la digestion de la collagénase du tissu de la glande mammaire donneuse |
| Boîtes de 60 mm Thermo | Scientific | 130181 | pour hacher les tissus |
| Sulfate d’alun de potassium | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | coloration de la glande mammaire monture entière lames |
| Vaporisateur d’anesthésie à usage vétérinaire | - | suivre le protocole institutionnel | |
| Bêta-dine ou iode | - | ||
| Tube de culture en verre borosilicaté pour l’homogénéisation | Fisher Scientific | 14-961-26 | pour l’homogénéisation du cerveau (utiliser un tube approprié pour l’homogénéisateur) |
| Carmin | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | coloration de la glande mammaire Lames de montage entier |
| Appareil de comptage | cellulaire | -- | |
| Nettoyer les cages d’animaux pour la récupération | - | - | suivre le protocole institutionnel |
| Collagénase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | digestion enzymatique de tissus de glandes mammaires hachés de rats donneurs |
| d’eau désionisée | - | pour solutions chimiques | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | pour hacher les tissus, milieux de digestion de la collagénase et remettre en suspension les mélanges de cellules épithéliales |
| EDTA | - | mélange de monodispersion | |
| Éthanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | fixateur de lames mammaires entières, lavages de lames mammaires entières, nettoyage des sites d’incision chirurgicale (dilué) |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Solution d’inactivation | d’hyclone | |
| Gaze | - | - | |
| Acide acétique glacial | Fisher Scientific | A38-212 | utilisation pour fixateur de lames mammaires entières (acide acétique glaciaire 1:4 dans 100 % d’éthanol) |
| HBSS | GIBCO | - | mélange monodispersion |
| Coussins chauffants | - | - | suivre le protocole institutionnel |
| Seaux à glace (x2) | - | - | |
| Incubateur avec rotation orbitale | - | - | doit être capable de maintenir 37° ; C, agitation à 220-225 tr/min (pour la digestion de la collagénase du tissu mammaire) |
| Anesthésie à l’isoflurane | - | - | suivre le protocole institutionnel |
| Microscope optique ou appareil photo numérique | - | - | visualisation de l’épithélium mammaire monté entier et/ou acquisition d’images |
| Homogénéisateur mécanique | Fisher | Scientific-TissueMiser ou modèles alternatifs | |
| Huile minérale, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | stockage à long terme de la glande mammaire nettoyée montages entiers |
| Réservoirs d’oxygène pour vaporisateur d’anesthésie | - | suivre le protocole institutionnel | |
| Serviettes en papier ou lingettes délicates | - | - | |
| Lames de microscope chargées positivement | Thermo Scientific | P4981-001 | supports entiers de tissu de la glande mammaire |
| Postopératoire analgésique | - | Protocole institutionnel | |
| Balance | Mesures du poids corporel des animaux, dosage approprié des analgésiques | ||
| Rasoir | - | tondeuses électriques ou autres | |
| Bocaux de coloration | - | minimum de 1 par lavage chimique, taille appropriée pour le nombre de lames, verre préféré | |
| Champs stériles | IMCO | 4410-IMC | utilisés lors de la transplantation |
| Ciseaux stériles et pinces x3 (autoclavés) | - | - | outils chirurgicaux autoclaves utilisés pour les donneurs et les receveurs |
| Seringues : 5 mL (ou plus) | - | - | pour la filtration stérile des milieux de digestion de la collagénase |
| Trypsine | Mélange monodispersique Worthington | ||
| Réceptacle de collecte des déchets pour liquides (coulés ou aspirés) | - | - | |
| Applicateur de clip de plaie, clips et outil de retrait | Fine Science Tools | 12020-00 | Fermeture de l’incision cutanée sur le tampon interscapulaire blanc |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | nettoyage de la glande mammaire lames de montage entier après coloration |
Références
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H.
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Réimpressions et autorisations
