Neuronal fiber længde inden for en tre-dimensionel struktur i en hjerne region er en pålidelig parameter til at kvantificere specifikke neuronal strukturel integritet eller degeneration. Denne artikel beskriver en stereologisk kvantificeringsmetode til måling af kolinerge fiberlængde i meynerts kernebasalis i mus som et eksempel.
Længden af kolinerge eller andre neuronal axoner i forskellige hjerneregioner er ofte korreleret med den specifikke funktion af regionen. Stereologi er en nyttig metode til at kvantificere neuronale profiler af forskellige hjernestrukturer. Her leverer vi en software-baseret stereologi protokol til at vurdere den samlede længde af kolinerge fibre i kernen basalis af Meynert (NBM) af basal forhjernen. Metoden bruger en rumkuglesonde til længdeestimater. De kolinerge fibre visualiseres ved cholin acetyltransferase (ChAT) immunfarvning med peberrod peroxidase-diaminobenzidin (HRP-DAB) detektionssystem. Farvningsprotokollen gælder også for fiber- og cellenummerestimering i forskellige hjerneområder ved hjælp af stereologisoftware. Stereologi protokollen kan bruges til estimering af eventuelle lineære profiler såsom kolinoceptive fibre, dopaminerge/catecholaminergic fibre, serotonergic fibre, astrocyt processer, eller endda vaskulære profiler.
Kvantitative skøn over længden og/eller tætheden af nervefibre i hjernen er vigtige parametre for neuropatologiske undersøgelser. Længden af kolinerge, dopaminerge, og serotonerge axoner i forskellige hjerneregioner er ofte korreleret med de specifikke funktioner i regionen. Fordi fordelingen af disse axoner er generelt heterogen, design-baseret stereologi bruges til at undgå bias under prøveudtagning. Rumkuglesonden af stereologi er designet til at give effektive og pålidelige foranstaltninger af linjelignende strukturer såsom neuronale fibre i en region af interesse1. Sonden gør en virtuel kugle, der pålægges systematisk i vævet til at måle linje skæringspunkter med overfladen af sonden. Fordi det er umuligt at sætte sfære sonder i vævet til analyse, den kommercielt tilgængelige software giver en virtuel tre-dimensionelle (3D) kugle, som er dybest set en række koncentriske cirkler af forskellige diametre, der repræsenterer overfladen af kuglesonden.
Selektiv kolinerge neurodegeneration er en af de konsekvente træk ved Alzheimers sygdom (AD)2,3,4. Dysfunktionel kolinerge transmission betragtes som en årsagsfaktor for kognitiv tilbagegang i AD. Kolinerge dysfunktion er også tydeligt i mange andre psykiske lidelser såsom Parkinsons, afhængighed, og skizofreni. Forskellige aspekter af kolinerge neurodegeneration er undersøgt i dyremodeller (f.eks reduktion i acetylcholin5, ChAT protein6, kolinerge fiber neurodegeneration i nærheden af amyloid plaques6, og fald i kolinerge fibre og synaptic varicosities7,8). Fiber degeneration menes at finde sted tidligere end neuronal tab, fordi kolinerge neuronal tab ikke altid observeres i undersøgelser. De fleste af de kolinerge neuroner er i de basale forhjernen og hjernestammen, og deres axoner projekt til forskellige hjerneregioner såsom korticeer og hippocampus. NBM er beliggende i basal forhjernen og viser sig at være en af de almindeligt ramte hjerneområder i AD.
Den fraktioneret metode stereologi er baseret på systematisk stikprøveaf et væv på flere niveauer. Sektionsprøvefraktion (SSF) er den ikke-computerbaserede systematiske prøveudtagning af sektioner til fraktionerets tenologiske metode. Arealprøvetagningsfraktion (ASF) er fraktionering af et område i området af interesse for sektionen. Tykkelse sprøveudtagning fraktion (TSF) er fraktioneringen af tykkelsen af en sektion. Rumkuglesonden giver os mulighed for at kvantificere interesseprofiler i en 3D-kugle på fraktionerede steder. Her bruger vi en rumkuglesonde til estimering af den samlede længde af kolinerge fibre i NBM af musehjernen til at illustrere procedurerne. Den nuværende protokol indeholder oplysninger om vævsbehandling, prøvetagningsmetoder til stereologi, immunhistokemisk farvning ved hjælp af ChAT antistof, og upartisk stereologi til at vurdere kolinerge fiber længde og fibertæthed i NBM af musen shjerne.
Her demonstrerer vi en metode til at vurdere tætheden af kolinerge fibre i NBM ved hjælp af en rumkugle (kugle) sonde. Denne sonde anslår den samlede fiberlængde i interesseområdet. Den samlede længde kan divideres med mængden af regionen for at få fibertætheden. For at anslå regionens volumen blev Kavalieri-pointtællingsmetoden anvendt. Cavalieri point count metoden er en upartisk og effektiv estimator af en 3D-referencevolumen for enhver region. Metoden beregner et skøn over arealet på en afskåret flade a…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud til W.Z.S. fra Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimers Association (NPSPAD-11-202149), og ressourcer fra Midtvesten Biomedical Forskningsfond.
ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |