마우스 뇌의 마이너트 핵 기저에서 콜린성 섬유 길이의 입체 추정
Summary
뇌 영역의 3차원 구조 내의 뉴런 섬유 길이는 특정 뉴런 구조적 무결성 또는 변성을 정량화하는 신뢰할 수 있는 파라미터이다. 본 문서는 예를 들어 마우스에서 Meynert의 핵 기저부 내에서 해 섬유 길이를 측정하는 입체 정량화 방법을 자세히 설명합니다.
Abstract
다양 한 뇌 영역에서 해 또는 다른 신경 축 색의 길이 종종 영역의 특정 기능과 상관. 입체학은 다양한 뇌 구조의 신경 프로필을 정량화하는 유용한 방법입니다. 여기에서 우리는 기저 전뇌의 Meynert (NBM)의 핵 기저에 있는 해 섬유의 총 길이를 추정하기 위하여 소프트웨어 기지를 둔 입체 프로토콜을 제공합니다. 이 메서드는 길이 추정에 대 한 공간 볼 프로브를 사용 합니다. 콜린성 섬유는 고추냉이 과산화 페멀티미노벤지딘(HRP-DAB) 검출 시스템으로 면역염색콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)에 의해 가시화된다. 염색 프로토콜은 또한 입체 소프트웨어를 사용하여 다양한 뇌 영역에서 섬유 및 세포 수 추정에 유효합니다. 입체 프로토콜은 담막염 섬유, 도파민성/카테콜라미네르균 섬유, 세로토닌섬유, 성상 세포 공정 또는 혈관 프로파일과 같은 선형 프로파일의 추정에 사용될 수 있습니다.
Introduction
뇌의 신경 섬유의 길이 및/또는 밀도의 정량적 추정은 신경 병리학 연구의 중요한 매개 변수입니다. 다양한 뇌 영역에서 콜린성, 도파민성 및 세로토닌성 축색의 길이는 종종 이 지역의 특정 기능과 상관관계가 있습니다. 이러한 축색의 분포는 일반적으로 이기종이기 때문에, 디자인 기반 의 입체학은 샘플링 하는 동안 바이어스를 피하기 위해 사용 됩니다. 입체학의 스페이스 볼 프로브는 관심 있는 영역에서 신경 섬유와 같은 라인형 구조의 효율적이고 신뢰할 수 있는 측정을 제공하도록 설계되었습니다1. 프로브는 조직에 체계적으로 부과되는 가상 구체를 만들어 프로브의 표면과 라인 교차점을 측정합니다. 분석을 위해 구체 프로브를 조직에 넣는 것은 불가능하기 때문에 시판되는 소프트웨어는 구 프로브의 표면을 나타내는 다양한 직경의 일련의 동심원인 가상 3차원(3D) 구를 제공합니다.
선택적 콜린성 신경변성은 알츠하이머병(AD)의 일관된 특징 중 하나이며2,3,4. 기능 장애 해 전송 AD에 인지 감소에 대 한 원인 요인으로 간주 됩니다. 해 기능 장애는 또한 파 킨 슨 병 등 다른 많은 정신 질환에서 분명 하다, 중독, 그리고 정신 분열 증. 해 신경 변성의 다른 양상은 동물 모델에서 연구된다 (예를 들어, 아세틸 콜린 감소5,ChAT 단백질6,아밀로이드 플라크 부근의 해 섬유 신경 변성6,해 섬유 및 시냅스 정맥류의 감소7,8). 섬유 변성은 신경 손실 보다 일찍 일어날 것으로 추정 된다, 해 신경 손실 은 항상 연구에서 관찰 되지 않기 때문에. 해 신경의 대부분은 기저 전뇌와 뇌 줄기에, 그리고 그들의 축색은 코르티메와 해마와 같은 다양한 뇌 영역에 프로젝트. NBM은 기저 전뇌에 위치하고 AD에서 일반적으로 영향을받는 뇌 영역 중 하나 인 것으로 나타났습니다.
입체학의 분획기 방법은 여러 수준에서 조직의 체계적인 무작위 샘플링을 기반으로합니다. 단면 샘플링 분율(SSF)은 스테레오로지의 분획기 방법에 대한 섹션의 비컴퓨터 기반의 체계적인 샘플링이다. 영역 샘플링 분율(ASF)은 섹션에서 관심 영역의 영역의 분획입니다. 두께 샘플링 분수(TSF)는 단면두께의 분수입니다. 스페이스 볼 프로브를 사용하면 분수 위치에서 3D 구의 관심 프로파일을 정량화할 수 있습니다. 여기서 우리는 마우스 뇌의 NBM에서 해 섬유의 총 길이의 추정을 위한 공간 볼 프로브를 사용하여 절차를 설명한다. 현재 프로토콜은 조직 처리, 입체학을 위한 샘플링 방법, ChAT 항체를 이용한 면역 조직화학적 염색, 마우스 뇌의 NBM에서 콜린성 섬유 길이 및 섬유 밀도를 추정하기 위한 편견 없는 입체학에 대한 세부 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 우주볼(sphere) 프로브를 이용하여 NBM에서 콜린성 섬유의 밀도를 추정하는 방법을 입증한다. 이 프로브는 관심 영역의 총 섬유 길이를 추정합니다. 전체 길이는 섬유 밀도를 얻기 위해 영역의 부피에 의해 나눌 수 있다. 영역의 부피를 추정하기 위해 카발리에리 포인트 카운트 방법을 사용하였다. Cavalieri 포인트 카운트 방법은 모든 지역에 대한 3D 기준 볼륨의 편견없고 효율적인 추정…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 의학 연구 및 개발 서비스, 재향 군인 업무부 (공로 검토 1I01 BX001067-01A2), 알츠하이머 협회 (NPSPAD-11-202149), 중서부 생물 의학의 자원에서 W.Z.S.에 대한 보조금에 의해 지원되었다 연구 재단.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
