Стерологические оценки длины холинергического волокна в ядре базалис Мейнерт мыши мозга
Summary
Длина нейронного волокна в трехмерной структуре области мозга является надежным параметром для количественной оценки конкретных нейрональных структурных целостности или дегенерации. В этой статье подробно стереологический метод количественной оценки для измерения длины холинергического волокна в ядре базалис Мейнерт у мышей в качестве примера.
Abstract
Длина холинергических или других нейрональных аксонов в различных областях мозга часто коррелирует с конкретной функцией региона. Стереология является полезным методом количественной оценки нейрональных профилей различных структур мозга. Здесь мы предоставляем программно-основанный протокол стереологии для оценки общей длины холинергических волокон в ядре базалис Айнерт (NBM) базального передних мозгов. Метод использует зонд космического шара для оценки длины. Холинергические волокна визуализированы холиновой ацетилтрансферазой (ChAT) иммуностоинг с хреном пероксидаза-диаминобензидин (HRP-DAB) системы обнаружения. Протокол окрашивания также действителен для оценки клетчатки и клеточного номера в различных областях мозга с помощью программного обеспечения стереологии. Протокол стереологии может быть использован для оценки любых линейных профилей, таких как холиноцептивные волокна, дофаминергические/катехоламинговые волокна, серотониновые волокна, астроцитные процессы или даже сосудистые профили.
Introduction
Количественные оценки длины и/или плотности нервных волокон в головном мозге являются важными параметрами невропатологических исследований. Длина холинергических, дофаминергических и серотонинергических аксонов в различных областях мозга часто коррелирует с конкретными функциями региона. Поскольку распределение этих аксонов, как правило, неоднородно, стереология на основе дизайна используется для предотвращения предвзятости во время отбора проб. Космический шар зонд стереологии был разработан, чтобы обеспечить эффективные и надежные меры линии, как структуры, такие как нейронные волокна в регионе, представляющих интерес1. Зонд делает виртуальную сферу, которая систематически навязывается в ткани для измерения пересечений линий с поверхностью зонда. Поскольку невозможно поместить сферы зондов в ткани для анализа, коммерчески доступное программное обеспечение обеспечивает виртуальную трехмерную (3D) сферу, которая в основном представляет собой ряд концентрических кругов различных диаметров, представляющих поверхность сферного зонда.
Селективная холинергическая нейродегенерация является одной из последовательных особенностей болезни Альцгеймера (AD)2,3,4. Дисфункциональная холинергическая передача считается причинным фактором для когнитивных снижение АД. Холинергическая дисфункция также проявляется во многих других психических расстройствах, таких как болезнь Паркинсона, наркомания и шизофрения. Различные аспекты холинергической нейродегенерации изучаются в животных моделях (например, снижение ацетилхолина5, ChAT белка6, холинергического волокна нейродегенерации в непосредственной близости от амилоидных бляшек6, и снижение холинергических волокон и синаптических варикозы7,8). Дегенерация волокна, как полагают, происходит раньше, чем потеря нейронов, потому что холинергические потери нейронов не всегда наблюдается в исследованиях. Большинство холинергических нейронов находятся в базальном предмозге и стволе мозга, и их аксоны проекта различных областях мозга, таких как кортики и гиппокампа. NBM расположен в базальном предмозге и оказался одним из часто пострадавших областей мозга в AD.
Метод фракционности стереологии основан на систематической случайной выборке ткани на нескольких уровнях. Раздел выборки фракции (SSF) является некомпьютерным основе систематической выборки разделов для фракционного метода стереологии. Фракция выборки (ASF) является фракцией области региона, интересуемого в разделе. Толщина фракции выборки (TSF) является фракция толщины раздела. Космический шар зонд позволяет нам количественно профили интерес в 3D сфере в дробных местах. Здесь мы используем космический шар зонд для оценки общей длины холинергических волокон в NBM мыши мозга, чтобы проиллюстрировать процедуры. Текущий протокол содержит подробную информацию о обработке тканей, методы отбора проб для стереологии, иммуногистохимическое окрашивание с использованием антитела CHAT, и беспристрастной стереологии для оценки длины холинергического волокна и плотности волокна в NBM мыши мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы демонстрируем метод оценки плотности холинергических волокон в НБМ с помощью космического шара (сферы) зонда. Этот зонд оценивает общую длину волокна в интересуемом регионе. Общая длина может быть разделена по объему региона, чтобы получить плотность волокна. Для оценки объем?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами W.З.S. от Медицинской службы исследований и разработок, Департамента по делам ветеранов (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Ассоциацией Альцгеймера (NPSPAD-11-202149), и ресурсами из Биомедицинской биомедицины Среднего Запада Научно-исследовательский фонд.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
