In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System
Summary
Für das Verständnis von Neoplasie ist die Entwicklung von murinen Modellen mit spezifischen Genen erforderlich, die bei Kopf- und Nackenkrebspatienten mutiert sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vitro-Transformation von primären murinen Zungenzellen unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus-Cas9-Systems vor, um murine HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen zu erzeugen.
Abstract
Die Verwendung von primären normalen Epithelzellen ermöglicht es, genomische Veränderungen, die für die zelluläre Transformation erforderlich sind, reproduzierbar zu induzieren, indem spezifische Mutationen in Onkogene und Tumorsuppressor-Gene eingeführt werden, indem clustered regulatory interspaced kurze palindromische Wiederholung (CRISPR)-basierte Genom-Editing-Technologie bei Mäusen. Diese Technologie ermöglicht es uns, die genetischen Veränderungen, die bei menschlichen Krebserkrankungen auftreten, mit Mäusen genau nachzuahmen. Durch die genetische Umwandlung muriner Primärzellen können wir die Entwicklung von Krebs, progression, Behandlung und Diagnose besser untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir creinduzible Cas9-Maus-Zungenepithelzellen, um die Genombearbeitung mit Adeno-assoziiertem Virus (AAV) in vitro zu ermöglichen. Insbesondere durch veränderung von KRAS, p53 und APC in normalen Zungenepithelzellen, erzeugten wir eine murine Kopf- und Halskrebs-Zelllinie (HNC) in vitro, die bei syngenischen Mäusen tumoriogen ist. Die hier vorgestellte Methode beschreibt detailliert, wie MAN HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen erzeugt und erklärt ihre Eignung zur Vorhersage der Tumorprogression bei syngenischen Mäusen. Wir stellen uns vor, dass diese vielversprechende Methode informativ und nützlich sein wird, um Tumorbiologie und Therapie von HNC zu studieren.
Introduction
HNC ist eine häufige Bösartigkeit weltweit1. Die Modellierung der Entstehung der HNC Neoplasie befindet sich derzeit an einem wissenschaftlichen Wendepunkt2. Während viele genetische Mutationen in HNC2,3,4 (z. B. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 und RAS) identifiziert wurden, bleiben die spezifischen Kombinationen genomischer Veränderungen, die zusammen erforderlich sind, um HNC zu induzieren, unklar.
Die aktuelle Verwendung menschlicher HNC-Zelllinien hat wesentlich dazu beigetragen, die Mechanismen im Zusammenhang mit Pathogenese und Behandlung zu klären3. Die Untersuchung menschlicher Zelllinien in immungeschwächten murinen Systemen hat jedoch ihre Grenzen, da diese Systeme den in vivo neoplastischen Prozess, die Rolle spezifischer Genmutationen und Behandlungsreaktionen in einer Immunmikroumgebung nicht behandeln. Daher ist die Entwicklung und Etablierung von murinen Zelllinien mit spezifischen genetischen Veränderungen von vorrangiger Bedeutung, um zu untersuchen, wie verschiedene Gene zum Transformationsprozess beitragen, und um neuartige molekülbasierte Therapien an immunkompetenten Mäusen zu testen.
Genfunktionsstudien in der biomedizinischen Forschung wurden durch Fortschritte in der DNA-Editing-Technologien erheblich beeinflusst, indem beispielsweise Doppelstrangbrüche (DSBs) eingeführt wurden, zum Beispiel5. Diese Technologien, einschließlich der Verwendung von Zinkfingernukleasen, Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornukleasen und gruppierten regulatorischen interspaceierten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR/Cas9), ermöglichen die Manipulation jedes Gens, das an seinem Ort von Interesse ist. Die neuesten CRISPR/Cas9-Systeme bestehen aus einer Guide-RNA (gRNA), die die Cas9-Nuklease anweist, um ein DSB an einem bestimmten Standort im Genom zu erzeugen. Dieses System hat eine umfassende Anerkennung bei der Modifizieren endogener Gene in jeder Zelle oder Zielgewebe gewonnen, selbst in den traditionell schwer zu behandelnden Organismen5. Es hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Systemen aufgrund seiner Einfachheit, Geschwindigkeit und Effizienz.
In der Onkologie hat die CRISPR/CAS9-Technologie die Notwendigkeit erfüllt, Krebszellen effektiv zu imitieren. Um dieses System im HNC zu etablieren, haben wir das potente KRAS-Onkogen und zwei wichtige Tumorsuppressorgene, APC und p536,manipuliert. Laut der GENIE-Datenbank7ist diese Kombination im HNC selten. RAS-Mutationen (HRAS, NRAS und KRAS) sind nur in 7 % aller HNC-Populationen vorhanden. Diese Tumoren neigen dazu, resistent gegen Therapie8,9.
Die Lieferung von Cas9 und seiner gRNA erfolgt durch virale Transduktion mit AAVs oder Lentiviren. Rekombinantes AAV ist oft die bevorzugte Methode zur Bereitstellung von Genen an Zielzellen aufgrund seiner hohen Titer, milde Immunantwort, Fähigkeit, eine breite Palette von Zellen zu transduzieren, und allgemeine Sicherheit. Mit Hilfe eines AAV-Systems wurden verschiedene gewebespezifische Mauszelllinien generiert, und neue Zelllinien werden noch entwickelt10,11,12. Es muss jedoch noch ein effizientes genomisches Bearbeitungssystem entwickelt werden, das murine HNC-Zelllinienmodelle erzeugen kann. In dieser Studie versuchten wir, ein in vitro AAV-Cas9-basiertes System zur Umwandlung von primären murinen Zungenzellen in einen tumorgenen Zustand zu entwickeln. Dieses einzigartige CRISPR/Cas9-Transformationsprotokoll und die etablierte Tumorzelllinie können verwendet werden, um die Biologie von HNC, die durch eine Vielzahl von genomischen Veränderungen induziert wird, besser zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Methoden wurden zuvor verwendet, um primäre Zellen in Kultur mit variablen Erfolgsgraden25,26,27,28zu transformieren. Die meisten dieser Methoden verwenden Maus-Fibroblastenzellen für die Transformation14,17,18,19 oder verwenden Karzinogene wie 4-Nitrochinol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Daniel Gitler für die Bereitstellung des pAd Delta 5 Helper Plasmids. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (to ME), der United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (an ME und MS), der Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (to ME), der Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (to ME) und der Foundation Concern (#7895) (ME) (ME) (an ME) finanziert. Stipendium: das Alon-Stipendium für ME- und BGU Kreitman-Stipendien an SJ und MP.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
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