Opprettelse av en genetisk konstruert murine hode-og nakke kreftcelle linje ved bruk av et Adeno-tilknyttet virus Cas9 system
Summary
Utvikling av murine modeller med spesifikke gener mutert i hode og nakke kreftpasienter er nødvendig for å forstå neoplasi. Her presenterer vi en protokoll for in vitro transformasjon av primær murine tungen celler ved hjelp av en adeno-assosiert virus-Cas9 system for å generere murine HNC cellelinjer med bestemte genomisk endringer.
Abstract
Bruken av primære normale epitelceller gjør det mulig å reproduserbar indusere genomisk endringer som kreves for mobilnettet transformasjon ved å innføre spesifikke mutasjoner i oncogenes og tumor Suppressor gener, ved hjelp av klynger regulatoriske oppdelt kort palindromic gjenta (CRISPR)-baserte Genova redigering teknologi i mus. Denne teknologien gjør det mulig for oss å nøyaktig etterligne de genetiske endringene som forekommer i menneskelig kreft ved hjelp av mus. Ved genetisk transformasjon av murine primære celler, kan vi bedre studere kreftutvikling, progresjon, behandling og diagnose. I denne studien, brukte vi grobunn-induserbart Cas9 mus tungen epitelceller for å aktivere Genova redigering ved hjelp av adeno-assosiert virus (AAV) in vitro. Nærmere bestemt, ved å endre KRAS, p53, og APC i normale tungen epitelceller, genererte vi en murine hode og nakke kreft (HNC) cellelinje in vitro, som er tumorigene i syngeneic mus. Metoden som presenteres her beskriver i detalj hvordan å generere HNC cellelinjer med spesifikke genomisk endringer og forklarer deres egnethet for å forutsi tumorprogresjon i syngeneic mus. Vi ser for oss at denne lovende metoden vil være informativ og nyttig å studere tumor biologi og behandling av HNC.
Introduction
HNC er en vanlig kreft verden over1. Modellering av Genesis av HNC neoplasi er for tiden på et vitenskapelig vendepunkt2. Mens mange genetiske mutasjoner har blitt identifisert i HNC2,3,4 (f. eks, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, og RAS) den spesifikke kombinasjoner av genomisk endringer som kreves i konserten for å indusere HNC fortsatt uklart.
Den nåværende bruk av menneskelige HNC cellelinjer har betydelig bidratt til å belyse mekanismene forbundet med patogenesen og behandling3. Men studiet av menneskelige cellelinjer i immunsupprimerte murine systemer har sine begrensninger, fordi disse systemene ikke ta opp in vivo neoplastic prosessen, rollen til spesifikke genmutasjoner, og behandling svar i en immun mikromiljøet. Derfor er utvikling og etablering av murine cellelinjer med spesifikke genetiske endringer av primær betydning for å studere hvordan ulike gener bidrar til transformerings prosessen og for å teste romanen molekyl BAS ert behandling i immunkompetente mus.
Gen funksjon studier i biomedisinsk forskning har blitt betydelig påvirket av fremskritt innen DNA-redigering teknologier, ved å innføre dobbel-strand pauser (DSBs), for eksempel5. Disse teknologiene, inkludert bruk av sink finger nukleaser, transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser, og klynger regulatoriske oppdelt korte palindromic gjentar (CRISPR/Cas9), tillate manipulering av ethvert gen av interesse på sitt geometriske. De nyeste CRISPR/Cas9 systemer består av en guide RNA (gRNA) som dirigerer Cas9 nuklease å generere en DSB på et bestemt sted i Genova. Dette systemet har fått omfattende anerkjennelse i å endre endogene gener i noen celle eller mål vev, selv i de mest tradisjonelt vanskelige å behandle organismer5. Den har flere fordeler fremfor andre systemer på grunn av sin enkelhet, hastighet og effektivitet.
I onkologi, CRISPR/CAS9 teknologi har oppfylt behovet for å effektivt etterligne kreftceller. For å etablere dette systemet i HNC, manipulert vi den potente KRAS diagnostisk og to viktige tumor Suppressor gener, APC og p536. Ifølge GENIE database7, denne kombinasjonen er sjelden i HNC. RAS mutasjoner (HRAS, NRAS, og KRAS) er tilstede i bare ~ 7% av alle HNC populasjoner. Disse tumorer tendens til å være motstandsdyktig mot terapi8,9.
Levering av Cas9 og dens gRNA oppnås gjennom viral Transduction bruker enten AAVs eller lentiviruses. Rekombinant AAV er ofte den foretrukne metoden for å levere gener for å målrette celler på grunn av sin høye titer, milde immunrespons, evne til å overfører et bredt spekter av celler, og generell sikkerhet. Ved hjelp av et AAV system, har ulike vev-spesifikke muse cellelinjer er generert, og nye cellelinjer er fortsatt under utvikling10,11,12. Imidlertid gjenstår en effektiv genomisk redigering system som kan generere murine HNC cellelinje modeller celler som skal utvikles. I denne studien forsøkte vi å utvikle et in vitro AAV-Cas9-basert system for å transformere primær murine tunge celler til en tumorigene tilstand. Denne unike CRISPR/Cas9 transformasjon protokollen og den etablerte tumor cellelinje kan brukes til å bedre forstå biologi av HNC indusert av et mangfold av genomisk endringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere metoder har tidligere blitt brukt til å transformere primær celler i kultur med varierende grad av suksess25,26,27,28. De fleste av disse metodene bruker mus Fibroblast celler for transformasjon14,17,18,19 eller bruke kreftfremkallende stoffer som 4-nitroquino…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Dr. Daniel Gitler for å gi oss med pAd delta 5 Helper plasmider. Dette arbeidet ble finansiert av Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (til ME), USA-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (til Me og MS), Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (til ME), Israels Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (til ME), og bekymringen Foundation (#7895) (til ME). Fellowship: den Alon fellesskap til meg og BGU Kreitman stipend til SJ og MP.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
