المجهر الجر المتكاملة مع ميكروفلويديكس للهجرة الجماعية الكيميائية
Summary
وغالبا ما تسترشد هجره الخلايا الجماعية في التنمية ، والتئام الجروح ، وورم خبيث السرطان من التدرجات من عوامل النمو أو الجزيئات الإشارات. وصف هنا هو نظام تجريبي الجمع بين المجهر الجر مع نظام ميكروفلويدريك ودليلا علي كيفيه قياس أليات الهجرة الجماعية تحت التدرج البيوكيميائية.
Abstract
تغير الخلايا أنماط الهجرة استجابه للمؤثرات الكيميائية ، بما في ذلك تدرجات المحفزات. الهجرة الخلوية في اتجاه التدرج الكيميائي ، والمعروفة باسم chemotaxis ، يلعب دورا هاما في التنمية ، والاستجابة المناعية ، التئام الجروح ، والسرطان الانبثاث. في حين ينظم شموتاكسيس هجره خلايا واحده ، فضلا عن مجموعات من الخلايا في الجسم المجري ، يركز البحث في المختبر علي المحور الكيميائي أحاديه الخلية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود الاداات التجريبية المناسبة. لسد هذه الفجوة ، الموصوفة هنا هو نظام تجريبي فريد يجمع بين ميكروفلويديكس ميكروباتيرنينج لإظهار اثار التدرجات الكيميائية علي هجره الخلايا الجماعية. وعلاوة علي ذلك ، يتم دمج المجهر الجر والمجهر أحادي الطبقة الإجهاد في النظام لتوصيف التغيرات في القوه الخلوية علي الركيزة ، وكذلك بين الخلايا المجاورة. كدليل علي المفهوم ، يتم اختبار هجره الجزر الدائرية المجهرية من الكليات البوليسية مادان-داربي (MDCK) تحت التدرج من عامل نمو الخلايا الكبدية (HGF) ، عامل تشتت معروف. وقد وجد ان الخلايا الواقعة بالقرب من تركيز اعلي من HGF تهاجر أسرع من تلك الموجودة علي الجانب الآخر داخل جزيرة الخلية. داخل نفس الجزيرة ، والجر الخلوية متشابهة علي كلا الجانبين ، ولكن الإجهاد بين الخلايا هو اقل بكثير علي الجانب من تركيز HGF اعلي. هذا النظام التجريبي يمكن ان يوفر فرصا جديده لدراسة ميكانيكا الهجرة الكيميائية من قبل التعاونيات الخلوية.
Introduction
الهجرة الخلوية في النظم البيولوجية هي ظاهره أساسيه تشارك في تكوين الانسجه ، والاستجابة المناعية ، والتئام الجروح1،2،3. الهجرة الخلوية هي أيضا عمليه هامه في بعض الامراض مثل السرطان4. غالبا ما تهاجر الخلايا كمجموعه بدلا من ان تكون فرديه ، والتي تعرف باسم هجره الخلايا الجماعية4،5. للخلايا للتحرك بشكل جماعي ، والاستشعار عن البيئة الدقيقة ضروري6. علي سبيل المثال, الخلايا تصور المحفزات الفيزيائية والاستجابة عن طريق تغيير الحركة, التفاعلات الخلية الركيزة, والتفاعلات خليه خليه, مما ادي إلى الهجرة الاتجاهية علي طول التدرج الكيميائي7,8, 9و10. واستنادا إلى هذا الاتصال ، تم احراز تقدم سريع في تقنيات مختبر علي رقاقه التي يمكن ان تخلق البيئات الدقيقة الكيميائية التي تسيطر عليها جيدا مثل التدرج من تشيمواتراكتانت11،12،13 . في حين ان هذه المختبر علي أساس رقاقه المستندة إلى موائع قد استخدمت سابقا لدراسة شموتاكسيس من الفرقة الخلوية أو خزان الخلوية14,15,16,17, انها وقد استخدمت في الغالب في سياق الهجرة خليه واحده18،19،20،21. أليات الكامنة وراء الاستجابة الجماعية الخلوية إلى التدرج الكيميائي لا تزال غير مفهومه جيدا14،22،23،24،25،26 . التالي ، فان تطوير منصة تمكن من السيطرة المكانية علي العوامل القابلة للذوبان وكذلك مراقبه الخلايا البيوفيزيائية في الموقع سيساعد علي كشف أليات الكامنة وراء هجره الخلايا الجماعية.
وضعت ووصفت هنا هو نظام ميكروفلويدريك متعددة التوجيه التي تمكن من توليد التدرج التركيز من العوامل القابلة للذوبان التي ينظم الهجرة من مجموعات الخلايا المنقوشة. في هذه الدراسة ، يتم اختيار عامل نمو الخلايا الكبدية (HGF) لتنظيم سلوك المهاجرة من Madin-داربي الكلية البوليسية (MDCK) الخلية. ومن المعروف hgf للتخفيف من سلامه خليه خليه وتعزيز حركيه الخلايا27,28. في النظام ميكروفلويديك, تحويل fourier المجهر الجر والمجهر أحاديه الطبقة الإجهاد وأدرجت أيضا, الذي يسمح تحليل الحركة, قوه مقلص, والتوتر بين الخلايا الناجمة عن الخلية التاسيسيه ردا علي hgf التدرج. داخل نفس الجزيرة ، والخلايا الموجودة بالقرب من تركيز اعلي من HGF تهاجر بشكل أسرع وتظهر مستويات التوتر بين الخلايا اقل من تلك الموجودة علي الجانب مع تركيز HGF اقل. وتشير النتائج إلى ان هذا النظام التجريبي الجديد مناسب لاستكشاف اسئله أخرى في مجالات تتعلق بالهجرة الخلوية الجماعية في اطار التدرجات الكيميائية لمختلف العوامل القابلة للذوبان.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتعد الهجرة الجماعية للخلايا التاسيسيه عمليه هامه اثناء التطوير والتجديد ، وغالبا ما يسترشد الاتجاه المهاجر بالتدرج الكيميائي لعوامل النمو4و23. اثناء الهجرة الجماعية ، تستمر الخلايا في التفاعل مع الخلايا المجاورة والركائز الاساسيه. هذه التفاعلات الميكان?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه مؤسسه البحوث الوطنية الكورية التي تمولها الحكومة الكورية (رقم الرعاية الاوليه-2017R1E1A1A01075103) ، منحه جامعه كوريا ، وبرنامج BK 21 Plus. وقد دعمته أيضا المعاهد الوطنية للصحة (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
References
- Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
- Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
- Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
- Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
- Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
- Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
- Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
- Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
- Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
- Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
- Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).
