केमोटेक्टिक सामूहिक प्रवास के लिए माइक्रोफ्लूइडिक्स के साथ एकीकृत ट्रैक्शन माइक्रोस्कोपी
Summary
विकास में सामूहिक सेल प्रवास, घाव भरने, और कैंसर मेटास्टेसिस अक्सर विकास कारकों या संकेत अणुओं की ढाल द्वारा निर्देशित है। यहाँ वर्णित एक प्रयोगात्मक प्रणाली एक microfluidic प्रणाली के साथ कर्षण माइक्रोस्कोपी के संयोजन और कैसे जैव रासायनिक ढाल के तहत सामूहिक प्रवास के यांत्रिकी परिमाणित करने के लिए एक प्रदर्शन है.
Abstract
कोशिकाएँ रासायनिक उद्दीपकों के प्रक्रिया के प्रत्युत्तर में प्रवास पैटर्न परिवर्तित करती हैं, जिसमें उद्दीपकों की प्रवणता भी शामिल होती है। एक रासायनिक ढाल की दिशा में सेलुलर प्रवास, chemotaxis के रूप में जाना जाता है, विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, घाव भरने, और कैंसर मेटास्टेसिस. जबकि chemotaxis एकल कोशिकाओं के प्रवास के साथ ही विवो में कोशिकाओं के संग्रह modulates, इन विट्रो अनुसंधान एकल सेल chemotaxis पर केंद्रित है, आंशिक रूप से उचित प्रयोगात्मक उपकरणों की कमी के कारण. उस अंतर को भरने के लिए, यहाँ वर्णित एक अद्वितीय प्रयोगात्मक प्रणाली है कि microfluidics और micropatterning को जोड़ती है सामूहिक सेल प्रवास पर रासायनिक gradients के प्रभाव को प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, कर्षण माइक्रोस्कोपी और मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी को सिस्टम में शामिल किया जाता है ताकि सब्सट्रेट पर सेलुलर बल में परिवर्तन के साथ-साथ पड़ोसी कोशिकाओं के बीच भी शामिल किया जा सके। सबूत के अवधारणा के रूप में, Madin-Darby कैनाइन गुर्दे (MDCK) कोशिकाओं के micropatterned परिपत्र द्वीपों के प्रवास hepatocyte विकास कारक (HGF), एक ज्ञात प्रकीर्णन कारक की एक ढाल के तहत परीक्षण किया है. यह पाया गया है कि HGF के उच्च एकाग्रता के पास स्थित कोशिकाओं को एक सेल द्वीप के भीतर विपरीत पक्ष पर उन लोगों की तुलना में तेजी से माइग्रेट. एक ही द्वीप के भीतर, सेलुलर कर्षण दोनों पक्षों पर समान है, लेकिन intercellular तनाव उच्च HGF एकाग्रता के पक्ष में बहुत कम है. इस उपन्यास प्रयोगात्मक प्रणाली सेलुलर सामूहिक द्वारा chemotactic प्रवास के यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए नए अवसर प्रदान कर सकते हैं.
Introduction
जैविक प्रणालियों में सेलुलर प्रवास एक मौलिक घटना ऊतक गठन में शामिल है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया , और घाव भरने1,2,3. कैंसर4जैसे कुछ रोगों में सेलुलर प्रवास भी एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है . कोशिकाएं प्रायः अलग-अलग के बजाय समूह के रूप में प्रवास करती हैं, जिसे सामूहिक कोशिका प्रवास4,5के रूप में जाना जाता है . कोशिकाओं के लिए सामूहिक रूप से स्थानांतरित करने के लिए, microenvironment के संवेदन आवश्यकहै 6. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं physicochemical उत्तेजनाओं अनुभव और गतिशीलता बदलने के द्वारा प्रतिक्रिया, सेल-सब्सट्रेट बातचीत, और सेल सेल बातचीत, एक रासायनिक ढालकेसाथ दिशात्मक प्रवास में जिसके परिणामस्वरूप7 ,8, 9,10. इस संबंध के आधार पर प्रयोगशाला-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकियों में तेजी से प्रगति की गई है जो अच्छी तरह से नियंत्रित रासायनिक सूक्ष्म वातावरण बना सकती हैं जैसे कि एक रसायन-उत्कर्ष11,12,13 . जबकि इन प्रयोगशाला पर एक चिप आधारित microfluidics पहले सेलुलर पहनावा या सेलुलर गोलोइड के chemotaxis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है14,15,16,17, वे ज्यादातर एकल कोशिका प्रवास18,19,20,21के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया है . रासायनिक ढाल के लिए एक सेलुलर सामूहिक प्रतिक्रिया अंतर्निहित तंत्र अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है14,22,23,24,25,26 . इस प्रकार, एक मंच है कि घुलनशील कारकों के spatiotemporal नियंत्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के जैवभौतिक के situ अवलोकन में सक्षम बनाता है के विकास के लिए सामूहिक सेल प्रवास के पीछे तंत्र को जानने में मदद मिलेगी.
विकसित और यहाँ वर्णित एक मल्टी चैनल microfluidic प्रणाली है कि घुलनशील कारकों की एकाग्रता ढाल है कि पैटर्न सेल समूहों के प्रवास modulates की पीढ़ी सक्षम बनाता है. इस अध्ययन में, हेपेटोसाइट विकास कारक (एचजीएफ) को मदिन-डार्बी के गुर्दे (एमडीसीके) कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार को विनियमित करने के लिए चुना जाता है। HGF सेल सेल अखंडता क्षीण और कोशिकाओं की गतिशीलता बढ़ाने के लिए जाना जाता है27,28. microfluidic प्रणाली में, फूरिये रूपांतरण कर्षण माइक्रोस्कोपी और मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी भी शामिल कर रहे हैं, जो गतिशीलता के विश्लेषण की अनुमति देता है, संकुचन बल, और एक HGF के जवाब में घटक कोशिकाओं द्वारा प्रेरित intercellular तनाव ग्रैडिएंट. एक ही द्वीप के भीतर, HGF के उच्च एकाग्रता के पास स्थित कोशिकाओं तेजी से माइग्रेट करें और कम HGF एकाग्रता के साथ पक्ष पर उन लोगों की तुलना में कम intercellular तनाव के स्तर को दिखाने. परिणाम ों का सुझाव है कि इस नई प्रयोगात्मक प्रणाली विभिन्न घुलनशील कारकों के रासायनिक gradients के तहत सामूहिक सेलुलर प्रवास को शामिल क्षेत्रों में अन्य सवालों का पता लगाने के लिए उपयुक्त है.
Protocol
Representative Results
Discussion
घटक कोशिकाओं का सामूहिक प्रवास विकास और पुनर्जनन के दौरान एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है , और प्रवास दिशा अक्सर विकास कारकों4,23के रासायनिक प्रवणता द्वारा निर्देशित होती है . सामूहिक …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) कोरियाई सरकार (MSIP) (नहीं) द्वारा वित्त पोषित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. NRF-2017R1E1A01075103), कोरिया विश्वविद्यालय अनुदान, और बीके 21 प्लस कार्यक्रम. यह भी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY0196) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
References
- Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
- Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
- Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
- Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
- Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
- Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
- Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
- Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
- Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
- Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
- Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).
