In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Résumé

Les complexités tissulaires des systèmes multicellulaires confondent l'identification de la relation causale entre les indices extracellulaires et les comportements cellulaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour étudier le lien direct entre les indices contact-dépendants et les axes de division utilisant des blastomeres d'embryon de C. elegans et des perles adhésives de polystyrène.

Résumé

Dans les systèmes multicellulaires, les cellules individuelles sont entourées par les différents indices physiques et chimiques provenant des cellules voisines et de l'environnement. Cette complexité tissulaire confond l'identification du lien de causalité entre les indices extrinsèques et la dynamique cellulaire. Un système multicellulaire reconstitué synthétiquement surmonte ce problème en permettant aux chercheurs de tester un signal spécifique tout en éliminant les autres. Ici, nous présentons une méthode pour reconstituer des modèles de contact de cellules avec le blastomere isolé de Caenorhabditis elegans et les perles adhésives de polystyrène. Les procédures impliquent l'enlèvement de coquille d'œuf, l'isolement blastomere en perturbant l'adhérence de cellule-cellule, la préparation des perles adhésives de polystyrène, et la reconstitution du contact de cellule-cellule ou de cellule-perle. Enfin, nous présentons l'application de cette méthode pour étudier l'orientation des axes de division cellulaire qui contribue à la régulation du modelage cellulaire spatial et de la spécification du destin cellulaire dans le développement des embryons. Cette méthode in vitro robuste, reproductible et polyvalente permet d'étudier les relations directes entre les modèles de contact cellulaire spatial et les réponses cellulaires.

Introduction

Pendant le développement multicellulaire, les comportements cellulaires (par exemple, l'axe de division) des cellules individuelles sont spécifiés par divers indices chimiques et physiques. Comprendre comment chaque cellule interprète cette information, et comment ils régulent l'assemblage multicellulaire comme une propriété émergente est l'un des objectifs ultimes des études de morphogénèse. L'organisme modèle C. elegans a contribué de manière significative à la compréhension de la régulation au niveau cellulaire de la morphogénèse comme la polarité cellulaire¹, la division cellulaire modelant¹, la décision du ....

Protocole

1. Préparation de perles de polystyrène adhésif

REMARQUE : Ce protocole ne nécessite pas de technique aseptique.

1. Peser 10 mg de perles de polystyrène modifiés de carboxylate dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
2. Pour laver les perles, ajouter 1 ml de tampon d'acide ethanesulfonic (MES) de 2 ml (N-(N-morpholino) dans le tube. Étant donné que le tampon MES ne contient pas de phosphate et d'acétate, ce qui peut réduire la réactivité du carbodiimide, il convient de l'utiliser dans la réaction de couplage de protéines. Vortex le tube pour mélanger les perles.
3. Faites tourner le tube pour 60 s à 2 000 x g v....

Résultats

Pour la préparation des perles, nous avons déterminé la quantité optimale de Rhodamine Red-X succinimidyl ester pour la souche transgénique exprimant GFP-myosin II et mCherry-histone (Figure 1A-D). Nous avons utilisé mCherry marqué histone comme un marqueur de la progression du cycle cellulaire. Parce que Rhodamine Red-X et mCherry seront illuminés par un laser de 561 nm, l'intensité optimale du signal Rhodamine Red-X est comparable à celle de l'histone pour permettre l'imag.......

Discussion

La reconstitution des modèles simplifiés de contact cellulaire permettra aux chercheurs de tester les rôles de modèles de contact cellulaire spécifiques dans différents aspects de la morphogénèse. Nous avons utilisé cette technique pour montrer que l'axe de division cellulaire est contrôlé par le contact physique avec des perles adhésives¹⁰. Comme la spécification de l'axe de division est cruciale pour le développement multicellulaire en contribuant à la morphogénèse¹⁴, div.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide	Alfa Aesar	AAA1080703	Pour la préparation des billes
Ensemble de tube d’aspirateur	Drummond	21-180-13	Pour l’isolement des blastomères.
Caenorhabditis elegans souche : N2,	Caenorhabditis de type sauvage Centre de génétique	N2	Souche utilisée dans cette étude Souche
Caenorhabditis elegans : KSG5, génotype : zuIs45 ; itIs37	en interne	KSG5	Souche utilisée dans cette étude
Mircopipets calibrés, 10 & micro ; L	Drummond	21-180-13	Pour l’isolement des blastomères
Billes de polystyrène modifiées au carboxylate (30 & micro ; m diamètre)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	Pour la préparation des billes
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	Pour l’isolement des blastomères. Travailler dans la hotte de culture tissulaire.
Clorox	Clorox	N. A.	Pour l’isolement des blastomères. Ouvrez une nouvelle bouteille lorsque le traitement à l’hypochlorite ne fonctionne pas bien.
Porte-lamelle	Dans la maison	N.A.	Pour l’isolement des blastomères.
Microscope de dissection : Zeiss Stemi 508 avec support M. La source de lumière est une LED intégrée. Le grossissement de l’oculaire est de 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Pour l’isolement des blastomères.
Sérum fœtal bovin, Qualifié One Shot, origine Canada	Gibco	A3160701	Pour l’isolement des blastomères. Travailler dans la hotte de culture tissulaire.
Aiguilles hypodermiques à glissement général et de précision, calibre 25	BD	14-826AA	Pour l’isolement des blastomères
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	Pour l’isolement des blastomères
Solution vitaminique MEM (100x)	Gibco	11120052	Pour l’isolement des blastomères.
MES (Fine White Crystals)	Fisher BioReagents	BP300-100	Pour la préparation des billes
Lame Multitest 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	Pour l’isolement des blastomères
PBS, solution saline tamponnée au phosphate, 10 x poudre	Fisher BioReagents	BP665-1	Pour la préparation des billes
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140148	la Isolation des blastomères.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	Pour l’isolement des blastomères
Chlorure de potassium	Bioshop	POC888	Pour l’isolement des blastomères
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomères	Sondes moléculaires	R6160	Pour la préparation
des billes Schneider' s Drosophila Stérile Milieu	Gibco 21720024		Pour l’isolement des blastomères. Travailler dans la hotte de culture tissulaire.
Chlorure de sodium	Bioshop	SOD001	Pour l’isolement des blastomères
Solution d’hydroxyde de sodium, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	Pour l’isolement des blastomères
Microscope confocal à disque rotatif : Yokogawa CSU-X1, Lunette inversée Zeiss Axiovert, Appareil photo Quant EM 512, objectif apochromatique 63X NA 1.4 Plan. Le système était contrôlé par Slidebook 6.0.	Innovation en imagerie intelligente	N.A.	Pour l’imagerie en direct
Filtres pour seringues, PTFE,	Basix	13100115	Pour l’isolement des blastomères.
Tube de laboratoire Tygon S3,, Formulation E-3603, Diamètre intérieur 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	Pour l’isolation des blastomères.
Tube de laboratoire Tygon S3, Formulation E-3603, Diamètre intérieur 6,35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	Pour l’isolement des blastomères.

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