Reconstitución in Vitro de patrones de contacto de células espaciales con Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres aislados y perlas de poliestireno adhesivo
Summary
Las complejidades tisulares de los sistemas multicelulares confunden la identificación de la relación causal entre las señales extracelulares y los comportamientos celulares individuales. Aquí, presentamos un método para estudiar el vínculo directo entre las señales dependientes del contacto y los ejes de división utilizando los blastómeros embrionarios de C. elegans y las perlas adhesivas de poliestireno.
Abstract
En los sistemas multicelulares, las células individuales están rodeadas por las diversas señales físicas y químicas procedentes de las células vecinas y el medio ambiente. Esta complejidad tisular confunde la identificación de la relación causal entre las señales extrínsicas y la dinámica celular. Un sistema multicelular reconstituido sintéticamente supera este problema al permitir a los investigadores probar una señal específica mientras elimina a otros. Aquí, presentamos un método para reconstituir patrones de contacto celular con caenorhabditis elegans blastomere aislado y perlas adhesivas de poliestireno. Los procedimientos implican la eliminación de cáscara de huevo, el aislamiento de blastomero al interrumpir la adhesión celular, la preparación de perlas adhesivas de poliestireno y la reconstitución del contacto de células celulares o de cuentas celulares. Por último, presentamos la aplicación de este método para investigar la orientación de los ejes de división celular que contribuye a la regulación del patrón celular espacial y la especificación del destino celular en el desarrollo de embriones. Este método in vitro robusto, reproducible y versátil permite el estudio de las relaciones directas entre los patrones de contacto de células espaciales y las respuestas celulares.
Introduction
Durante el desarrollo multicelular, los comportamientos celulares (por ejemplo, el eje de división) de las células individuales se especifican mediante varias señales químicas y físicas. Entender cómo la célula individual interpreta esta información, y cómo regulan el ensamblaje multicelular como una propiedad emergente es uno de los objetivos finales de los estudios de morfogénesis. El organismo modelo C. elegans ha contribuido significativamente a la comprensión de la regulación a nivel celular de la morfogénesis como la polaridad celular1,el patrón de división celular1,la decisión del destino celular2,y las regulaciones a escala de tejido como el cableado neuronal3 y la organogénesis4,5. Aunque hay varias herramientas genéticas disponibles, los métodos de ingeniería de tejidos son limitados.
El método de ingeniería de tejidos más exitoso en el estudio C. elegans es el aislamiento clásico de blastomero6; como c. elegans embrión está rodeado por una cáscara de huevo y una barrera de permeabilidad7, su eliminación es uno de los principales procedimientos de este método. Si bien este método de aislamiento de blastomero permite la reconstitución del contacto de células celulares de una manera simplificada, no permite la eliminación de señales no deseadas; el contacto celular todavía plantea señales mecánicas (por ejemplo, adhesión) y químicas, lo que limita nuestra capacidad de analizar completamente la relación causal entre la señal y el comportamiento celular.
El método presentado en este artículo utiliza perlas de poliestireno modificadas de carboxilato que pueden unirse covalentemente a cualquier molécula reactiva de amina, incluidas las proteínas como ligandos. Particularmente, utilizamos una forma reactiva de amina de Rhodamine Red-X como ligando para hacer cuentas tanto visualmente rastreables como adhesivas a la célula. Los grupos carboxilo de superficie de cordón y grupos primarios de amina de molécula de ligando están acoplados por carbodiimida soluble en agua 1-etil-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimida (EDAC)8,9. Las perlas adhesivas obtenidas permiten los efectos de la señal mecánica en la dinámica celular10. Hemos utilizado esta técnica para identificar las señales mecánicas necesarias para la orientación de división celular10.
Protocol
Representative Results
Discussion
La reconstitución de patrones de contacto celular simplificados permitirá a los investigadores probar las funciones de patrones de contacto celular específicos en diferentes aspectos de la morfogénesis. Hemos utilizado esta técnica para demostrar que el eje de división celular está controlado por el contacto físico con cuentas adhesivas10. Como especificación del eje de división es crucial para el desarrollo multicelular al contribuir a la morfogénesis14,divisió…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a James Priess y Bruce Bowerman por su asesoramiento y suministro de cepas de C. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto y Life Sciences Institute Imaging Core Facility por compartir equipos y reactivos, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim para el mantenimiento de C. elegans y la lectura crítica de nuestro manuscrito. Nuestro trabajo cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
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