Beskrevet er en proteomics workflow for at identificere protein interaktion partnere fra en nuklear subcellulære fraktion ved hjælp af immun affinitet berigelse af et givet protein af interesse og label-fri massespektrometri. Arbejdsprocessen omfatter subcellulære fraktionering, immunopræcipitation, filter Aided prøveforberedelse, offline oprydning, massespektrometri, og en downstream Bioinformatik pipeline.
Immun affinitet rensning massespektrometri (IP-MS) er dukket op som en robust kvantitativ metode til at identificere protein-protein interaktioner. Denne publikation præsenterer en komplet interaktion proteomics workflow designet til at identificere lav overflod protein-protein interaktioner fra kernen, der også kunne anvendes til andre subcellulære rum. Denne arbejdsgang omfatter subcellulære fraktionering, immunoprecipitation, prøveforberedelse, offline oprydning, enkelt skudt label-fri massespektrometri, og downstream beregningsmæssige analyse og datavisualisering. Vores protokol er optimeret til påvisning af opdelte, lave overflod interaktioner, der er svære at identificere fra hele celle lysater (f. eks. transkriptionsfaktor interaktioner i kernen) ved immunopræcipitation af endogene proteiner fra fraktionerede subcellulære rum. Prøve forberedelses rørledningen skitseret her giver detaljerede instruktioner til fremstilling af HeLa celle nukleare ekstrakt, immun affinitet rensning af endogene agn protein, og kvantitativ massespektrometri analyse. Vi diskuterer også metodologiske overvejelser for at udføre storstilet immunopræcipitation i massespektrometri-baserede interaktions profilerings eksperimenter og giver retningslinjer for evaluering af datakvaliteten for at skelne ægte positivt protein interaktioner fra ikke-specifikke interaktioner. Denne fremgangsmåde er påvist her ved at undersøge den nukleare interactome af CMGC kinase, DYRK1A, en lav forekomst protein kinase med dårligt definerede interaktioner i kernen.
Den menneskelige proteom udviser stor strukturel og biokemisk diversitet gennem dannelsen af stabile multisubunit komplekser og forbigående protein-protein interaktioner. Derfor er det almindeligt nødvendigt at identificere interaktions partnere for et protein af interesse i undersøgelser for at afdække molekyl mekanismen. Nylige fremskridt inden for affinitets rensning protokoller og fremkomsten af høj opløsning hurtig scanning massespektrometri instrumentering har gjort det muligt let kortlægning af protein interaktion landskaber i en enkelt upartisk eksperiment.
Protein interaktions protokoller anvender almindeligvis ektopiske udtryks systemer med affinitets mærkede fusions konstruktioner til at identificere protein interaktioner uden at kræve antistoffer af høj kvalitet, der genkender et protein af interesse1,2. Men, epitop tag-baserede metoder har flere ulemper. Fysiske interaktioner med epitop kan føre til påvisning af ikke-specifikke copurificerende proteiner3. Desuden kan fusion af disse epitop Tags til N-eller C-terminalen af et protein blokere indfødte protein-protein interaktioner, eller forstyrre proteinfoldning at fremme ikke-fysiologiske konstellationer4. Desuden overudtrykker ektopisk-udtryks systemer typisk agn-proteinet ved suprafysiologiske koncentrationer, hvilket kan resultere i identifikation af kunstige protein interaktioner, især for doserings følsomme gener5. For at omgå disse problemer, kan den endogene agn protein være immunoprecipitated sammen med tilhørende interagerende bytte proteiner, forudsat tilgængeligheden af en høj kvalitet antistof, der genkender den indfødte protein.
Forudsat her er en interaktion proteomics workflow for påvisning af nukleare interactome af et endogene protein ved hjælp af CMGC protein kinase DYRK1A som et eksempel. Afbrydelse af DYRK1A kopi nummer, aktivitetsniveau, eller udtryk kan forårsage alvorlige intellektuelle handicap hos mennesker, og embryonale dødelighed i mus6,7,8,9. DYRK1A udstiller dynamisk spatiotemporale regel10, og opdelte protein interaktioner11,12, der kræver tilgange i stand til at detektere lav overflod interaktions partnere specifikke for forskellige subcellulære rum.
Denne protokol anvender cellulær fraktionering af humane HeLa-celler til cytosol og nucleoplasma fraktioner, immunopræcipitation, prøveforberedelse til massespektrometri og en oversigt over en bioinformatisk pipeline til evaluering af datakvalitet og visualisering af resultater, med R-scripts til analyse og visualisering (figur 1). Proteomics softwarepakker, der anvendes i dette workflow er alle frit tilgængelige for download eller kan tilgås via en web-grænseflade. For yderligere information om software og beregningsmæssige metoder, dybdegående tutorials og instruktion er tilgængelige på de medfølgende links.
Den proteomics workflow skitseret her giver en effektiv metode til at identificere høj-tillid protein eksterne for et protein af interesse. Denne fremgangsmåde mindsker kompleksiteten af eksemplet gennem subcellulære brøk og fokuserer på at øge identifikations interaktions partnerne gennem robust prøveforberedelse, offline prøve oprydning og streng kvalitetskontrol af LC-MS-systemet. Den analyse af downstream-data, der beskrives her, giver mulighed for en simpel statistisk vurdering af de proteiner, der identificeres som kopurificerende med agn. Men på grund af et stort antal eksperimentelle variabler (skala, cellelinje, antistof valg), hvert eksperiment kræver forskellige cutoffs og overvejelser vedrørende datavisualisering og berigelse.
Det første design overvejelse i et IP-MS eksperiment er udvælgelsen af antistoffer, der vil blive anvendt til copurifikation af det protein af interesse sammen med sine interagerende partnere. Mens tilgængeligheden af kommercielle antistoffer er udvidet til at dække større dele af den menneskelige proteom i løbet af de sidste mange årtier, er der stadig mange proteiner, for hvilke reagenser er begrænset. Desuden kan antistoffer, der er blevet valideret til applikationer såsom Western blot detektion, være ude af stand til selektiv berigelse af målproteinet i et immunopcipitation eksperiment. Forud for gennemførelsen af en storstilet interaktion proteomics eksperiment, foreslås det at fuldføre en IP fra en 90% flydende 10 cm parabol, eller tilsvarende celle nummer, og sonde for målet protein af interesse ved vestlige blotting. Hvis der er mere end et enkelt antistof til rådighed for immunopræcipitation, foreslås det desuden at vælge flere antistoffer, der genkender epitoper inden for forskellige dele af proteinet. Binding af et antistof til et lokkemad kan indbinde den nødvendige bindende grænseflade for formodede interagerende partnere. Udvælgelse af en sekundær epitop for agn protein vil øge dækningen af interaktionsprofilen identificeret ved en massespektrometri-baseret eksperiment.
En anden større overvejelse ligger i udvælgelsen af passende kontrol for at skelne høj-tillid interaktioner fra lav-tillid eller uspecifikke interaktioner fra dem, der identificeres som copurificerende med agn. Den strengeste kontrol for et IP-MS-eksperiment er at fuldføre chromatinimmunpræcipitation fra en crispr ko cellelinje af agn. En sådan kontrol muliggør identifikation og filtrering af ikke-specifikke proteiner, der binder direkte til antistoffet i stedet for agn proteinet. I tilfælde, hvor det ikke er muligt at generere en CRISPR KO-cellelinje af hvert lokkemad, kan der anvendes en IgG-perle kontrol af samme isotype af agn-antistoffet. I eksperimenter med et panel af antistoffer, der repræsenterer flere arter, kan brugen af en perler kun kontrol være passende, men vil øge antallet af falske positiver identificeret som høj-tillid Interactors.
Udvælgelsen af den cellelinje, der anvendes i et IP-MS-eksperiment, afhænger af flere nøglefaktorer. Protein ekspression og lokalisering er i høj grad afhængig af celletype. Mens RNA-udtryks estimater kan findes for de fleste gener i mange almindeligt anvendte cellelinjer, er protein ekspression dårligt korreleret med RNA-udtryk og skal bestemmes eksperimentelt25. Cellelinjer, hvor en agn protein udtrykkes i meget lav kopi nummer bør undgås at omgå problemer i forbindelse med drastiske stigninger i cellekultur skala, der kan være påkrævet. Det skal dog bemærkes, at prøveforberedelse kan optimeres til påvisning af meget lave forekomst proteiner. Den filter Aided prøve prep (FASP) metode, mens robust, kan forårsage en mere end 50% tab af peptid i en prøve. Single-pot solid-fase-forstærket Prøveforberedelse (SP3) er en effektiv metode til at generere prøver til massespektrometri analyse, der minimerer Sample tab26. Den forøgede opsving aktiveret af den SP3 metode i prøveforberedelse kan en nyttig alternativ i indeværende arbejdsgang nemlig kvantificering i proteiner at falde i nærheden af den grænse i opdagelse.
Denne proteomics workflow er blevet anvendt på tværs af mange nukleare lokturer, herunder kinaser, E3 ubiquitin ligaser, og stilladser medlemmer af multisubunit komplekser. Forudsat korrekt validering af antistof reagenser, vellykket udførelse af denne arbejdsgang vil resultere i påvisning af høj-tillid protein nukleare interaktion partnere for et protein af interesse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en stor udfordring Grant til W.M.O. fra Linda Crnic Institute for down Syndrome og af en DARPA samarbejdsaftale 13-34-RTA-FP-007. Vi vil gerne takke Jesse Kurland og Kira Cozzolino for deres bidrag i læsning og kommentering på manuskriptet.
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
Phosphate Buffered Saline | |||
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |