मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए ओवेरियन कैंसर ऊतकों और नियंत्रण ओवेरियन ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी
Summary
यह लेख मानव अंडाशय के कैंसर ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने और मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए ओवेरियन ऊतकों को नियंत्रित करने के लिए घनत्व ढाल केंद्रीकरण के संयोजन में अंतर-गति केंद्रीकरण का प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसके परिणामस्वरूप एक उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल नमूना और उच्च-थ्रूपुट और उच्च प्रजनन क्षमता मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण मानव ओवेरियन कैंसर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम का।
Abstract
ओवेरियन कैंसर उच्च मृत्यु दर लेकिन अस्पष्ट आणविक तंत्र के साथ एक आम स्त्री रोग है। अधिकांश अंडाशय के कैंसर का निदान उन्नत चरण में किया जाता है, जो चिकित्सा को गंभीर रूप से बाधित करता है। माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन मानव अंडाशय के कैंसर की एक पहचान हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा चयापचय, सेल सिग्नलिंग और ऑक्सीडेटिव तनाव के केंद्र हैं। ओवेरियन ऊतक को नियंत्रित करने की तुलना में अंडाशय के कैंसर में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के परिवर्तनों में गहराई से अंतर्दृष्टि से ओवेरियन कैंसर के आणविक तंत्र की गहराई से समझ और प्रभावी और विश्वसनीय बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज को लाभ होगा। मानव अंडाशय के कैंसर का विश्लेषण करने और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम को नियंत्रित करने के लिए सापेक्ष और पूर्ण क्वांटिफिकेशन (iTRAQ) मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए एक आइसोबेरिक टैग के साथ मिलकर एक प्रभावी माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी विधि प्रस्तुत की जाती है, जिसमें अंतर-गति केंद्रीकरण, घनत्व ग्रेडेंट सेंट्रलियूगेशन, माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों का गुणवत्ता मूल्यांकन, ट्राइप्सिन के साथ प्रोटीन पाचन, आईटीआरक्यू लेबलिंग, मजबूत cation एक्सचेंज अंशीकरण (SCX), लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एलसी), टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/ एमएस), डेटाबेस विश्लेषण, और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का मात्रात्मक विश्लेषण। मानव अंडाशय के कैंसर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के कवरेज को अधिकतम करने और मानव अंडाशय के कैंसर में विभेदित रूप से व्यक्त माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन प्रोफाइल को प्राप्त करने के लिए कई प्रोटीन ों की सफलतापूर्वक पहचान की गई है।
Introduction
ओवेरियन कैंसर एक सामान्य स्त्री रोग है जिसमें मृत्यु दर अधिक होती है लेकिन अस्पष्ट आणविक तंत्र1,2। अधिकांश ओवेरियन कैंसर का निदान उन्नत चरण में किया जाता है, जो चिकित्सा को गंभीर रूप से बाधित करता है। माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन मानव अंडाशय के कैंसर की एक पहचान हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा चयापचय, सेल सिग्नलिंग और ऑक्सीडेटिव तनाव3,4,5,6,7के केंद्र हैं। ओवेरियन ऊतक को नियंत्रित करने की तुलना में अंडाशय के कैंसर में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के परिवर्तनों में गहराई से अंतर्दृष्टि से ओवेरियन कैंसर के आणविक तंत्र की गहराई से समझ और प्रभावी और विश्वसनीय बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज को लाभ होगा। माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म का प्रस्ताव किया गया है और कैंसर थेरेपी के लिए एक लक्ष्य के रूप में मान्यता दी गई है, और एंटीमाइटोकॉन्ड्रियल थेरेपी अंततः कैंसर8की पुनरावृत्ति और मेटास्तासिस को रोकने के लिए बहुत फायदेमंद हो सकती है। व्यक्तिगत मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग को कैंसर स्तरीकरण और भविष्य कहनेवाली रणनीतियों9,10के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में भी पहले से ही प्रचलित किया जाता है ।
इस शोध का दीर्घकालिक लक्ष्य ओवेरियन कैंसर और नियंत्रण अंडाशय के ऊतकों के बीच माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेओम परिवर्तन के स्पष्टीकरण के लिए ओवेरियन कैंसर का अध्ययन करने के लिए एक मात्रात्मक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेओमिक्स विधि का विकास और उपयोग करना है, और उनके आणविक नेटवर्क में एक व्यवस्थित बहु-ओमिक्स कोण11,12से परिवर्तन होता है, जिसके परिणामस्वरूप ओवेरियन कैंसर के आणविक तंत्रों के स्पष्टीकरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित आणविक बायोमार्कर13 की खोज होगी, भविष्यवाणी, और अंडाशय के कैंसर रोगियों के व्यक्तिगत उपचार। 3,4 लेबलिंगसापेक्ष और पूर्ण क्वांटिफिकेशन (ITRAQ) के लिए आइसोबेरिक टैग माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। मानव अंडाशय के कैंसर और नियंत्रण अंडाशय ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों की तैयारी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम्स3के ITRAQ मात्रात्मक विश्लेषण के लिए शर्त है। माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी iTRAQ मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के साथ मिलकर मानव अंडाशय के कैंसर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के बारे में दीर्घकालिक अनुसंधान कार्यक्रमों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम संदर्भ मानचित्र3की स्थापना सहित, विभेदित रूप से व्यक्त माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइल4,14 और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का विश्लेषण, जिसमें फॉस्फोरिलेशन शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप पहले ही महत्वपूर्ण सिग्नलिंग मार्ग की खोज हुई है मानव अंडाशय के कैंसर 5 में नेटवर्कपरिवर्तन,ऊर्जा चयापचय4में परिवर्तन सहित, लिपिड चयापचय, और mitophagy मार्ग-सिस्टम3.
पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि घनत्व ढाल केंद्रीकरण के संयोजन में अंतर-गति केंद्रीकरण मानव अंडाशय के कैंसर से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग और शुद्ध करने और ओवेरियन ऊतकों को नियंत्रित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है3,4,5,14। आईटीआरक्यू लेबलिंग के साथ-साथ मजबूत cation एक्सचेंज (SCX)-लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एलसी)-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों से प्रोटीन का पता लगाने, पहचानने और उसकी मात्रा निर्धारित करने की प्रमुख तकनीक है ।
यहां, माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ITRAQ मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के साथ मिलकर किया गया है। मानव अंडाशय के कैंसर ऊतक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के विश्लेषण में इनका सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। प्रोटोकॉल में नमूने तैयार करना, अंतर-गति केंद्रीकरण, घनत्व ग्रेडेंट सेंट्रलिजन, माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों का गुणवत्ता आकलन, ट्राइप्सिन के साथ प्रोटीन पाचन, ITRAQ लेबलिंग, SCX अंश, एलसी, एमएस/एमएस, डाटाबेस खोज, और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का मात्रात्मक विश्लेषण शामिल है । इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल आसानी से अन्य मानव ऊतक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम का विश्लेषण करने के लिए अनुवाद करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन अंडाशय के कैंसर की एक पहचान है। मानव अंडाशय के कैंसर से उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों की तैयारी और बड़े पैमाने पर मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए ऊतकों को नियंत…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को हुआन प्रांतीय सौ प्रतिभा योजना (X.Z.), प्रतिभा परिचय के लिए Xiangya अस्पताल कोष (XZ के लिए), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ८१५७२२७८ और ८१२७२७९८ XZ के लिए), चीन से अनुदान “८६३” योजना द्वारा समर्थित था परियोजना (अनुदान संख्या 2014A020610-1 XZ के लिए), और चीन के हुआन प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 14JJ7008 XZ के लिए) । X.Z. वर्तमान पांडुलिपि के लिए अवधारणा की कल्पना की, माइटोकॉन्ड्रिया नमूनों के iTRAQ मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स डेटा प्राप्त किया, लिखा था और पांडुलिपि संशोधित, प्रासंगिक काम समंवित, और वित्तीय सहायता और इसी के लिए जिंमेदार था काम. एच.एल. तैयार माइटोकॉन्ड्रिया नमूने। एसक्यू ने आंशिक कार्य में भाग लिया । X.H.Z लेखन और संपादित अंग्रेजी भाषा में भाग लिया । एन.एल. ने ITRAQ प्रोटेओमिक्स डेटा का विश्लेषण किया। सभी लेखकों ने अंतिम पांडुलिपि को मंजूरी दी ।
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
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