Beredning av Mitokona från äggstocks cancer vävnader och kontrollera äggstocksvävnad för kvantitativ proteomik analys
Summary
Denna artikel presenterar ett protokoll av differential-Speed centrifugering i kombination med densitet gradient centrifugering att separera mitokonskerna från mänskliga äggstockscancer vävnader och kontrollera äggstocksvävnad för kvantitativ proteomik analys, resulterar i en hög kvalitet mitokondriellt prov och hög genomströmning och hög reproducerbarhet Kvantitativ proteomik analys av en mänsklig äggstockscancer mitokondriell Proteome.
Abstract
Äggstockscancer är en vanlig gynekologisk cancer med hög dödlighet men oklar molekylär mekanism. De flesta äggstockscancer diagnostiseras i det avancerade stadiet, vilket allvarligt hämmar terapi. Mitokondriella förändringar är ett kännetecken för mänskliga äggstockscancer, och mitokondrier är centra för energimetabolism, cellsignalering, och oxidativ stress. Djupgående insikter i förändringar av mitokondriella proteomen i äggstockscancer jämfört med kontroll äggstocksvävnad kommer att gynna djupgående förståelse av de molekylära mekanismerna för äggstockscancer, och upptäckten av effektiva och pålitliga biomarkörer och terapeutiska mål. En effektiv mitokondriell förberedelse metod tillsammans med en isobarisk tagg för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) kvantitativa proteomik presenteras här för att analysera Human äggstockscancer och kontrollera mitokondriella proteomes, inklusive differential hastighets centrifugering, densitetsgradientcentrifugering, kvalitetsbedömning av mitokondriella prover, proteinnedbrytning med trypsin, iTRAQ-märkning, stark katjonbytarfraktionering (SCX), vätskekromatografi (LC), tandemmasspektrometri (MS/ Databas analys och kvantitativ analys av mitokondriella proteiner. Många proteiner har framgångsrikt identifierats för att maximera täckningen av den mänskliga äggstockscancer mitokondriell proteomet och för att uppnå differentially uttryckt mitokondriell protein profil i mänskliga äggstockscancer.
Introduction
Äggstockscancer är en vanlig gynekologisk cancer med hög dödlighet men oklar molekylär mekanism1,2. De flesta av äggstockscancer diagnostiseras i det avancerade stadiet, som allvarligt hämmar terapi. Mitokondriella förändringar är ett kännetecken för mänskliga äggstockscancer, och mitokondrier är centra för energimetabolism, cellsignalering, och oxidativ stress3,4,5,6,7. Djupgående insikter i förändringar av mitokondriella proteomen i äggstockscancer jämfört med kontroll äggstocksvävnad kommer att gynna djupgående förståelse av de molekylära mekanismerna för äggstockscancer, och upptäckten av effektiva och pålitliga biomarkörer och terapeutiska mål. Mitokondriell metabolism har föreslagits och erkänts som ett mål för cancerbehandling, och antimitokondriell terapi kan i slutändan vara mycket fördelaktigt för att förhindra upprepning och metastaser av cancer8. Individuell metabolisk profilering är också redan praktiseras som ett användbart verktyg för cancer stratifiering och prediktiva strategier9,10.
Det långsiktiga målet med denna forskning är att utveckla och använda en kvantitativ mitokondriell proteomik metod för att studera äggstockscancer för klargörande av mitokondriella proteomförändringar mellan äggstockscancer och kontroll av äggstocks vävnader, och deras molekylära nätverksförändringar från en systematisk multi-omics vinkel11,12, vilket kommer att resultera i upptäckten av mitokonkaniriktade molekylära biomarkörer13 för förtydligande av de molekylära mekanismerna för äggstockscancer, och individanpassad behandling av äggstockscancer patienter. Isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering (itraq) märkning3,4 är en effektiv metod för att kvantifiera mitokondriella protein förändringar. Beredning av högkvalitativa mitokondriella prover från mänsklig äggstockscancer och kontroll äggstocksvävnad är förutsättningen för itraq kvantitativ analys av mitokondriella proteom3. Mitokondriell beredning tillsammans med itraq Kvantitativ proteomik har framgångsrikt använts i långsiktiga forskningsprogram om den humana ovarialcancermitokondrieproteomen, inklusive inrättandet av mitokondriella proteomet referenskartor3, analysen av Differentiellt uttryckt mitokondriella profiler4,14 och post-translationella modifieringar, inklusive fosforylering, som redan har resulterat i upptäckten av viktiga signalering väg nätverk förändringar i mänskliga äggstockscancer5, inklusive förändringar i energimetabolism4, lipid metabolism, och mitophagy Pathway-system3.
Tidigare studier har funnit att differential-Speed centrifugering i kombination med densitet gradient centrifugering är en effektiv metod för att isolera och rena mitokonskerna från mänsklig äggstockscancer och kontrollera äggstocks vävnader3,4,5,14. Itraq-märkningen tillsammans med Strong cation Exchange (SCX)-vätskekromatografi (LC)-tandem mass spektrometri (MS/MS) är den viktigaste tekniken för att upptäcka, identifiera och kvantifiera proteinerna från de preparerade mitokondriella proverna.
Här beskrivs detaljerade protokoll för mitokondriell beredning tillsammans med iTRAQ Kvantitativ proteomik. Dessa har framgångsrikt använts i analysen av mänskliga äggstockscancer vävnad mitokondriella proteomes. Protokollen omfattar beredning av prover, differential hastighet centrifugering, densitet gradient centrifugering, kvalitetsbedömning av mitokondriella prover, proteinnedbrytning med trypsin, iTRAQ märkning, SCX fraktionering, LC, MS/MS, databas sökning, och kvantitativ analys av mitokondriella proteiner. Dessutom, detta protokoll översätter lätt att analysera andra mänskliga vävnad mitokondriella proteomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriella förändringar är ett kännetecken för äggstockscancer. Beredning av högkvalitativa mitokondrieprover från Human äggstockscancer och kontroll vävnader för storskalig Kvantitativ proteomik gynnar den djupgående förståelsen av mitokondriell funktion i ovarialcancerpatogenes och mitokondriella molekylära nätverksförändringar, och hjälper till att klargöra dess molekylära mekanism för efterföljande upptäckt av mål terapi och effektiva biomarkörer baserade på mitokondrier<sup class="xref…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Hunan Provincial Hundred Talent plan (till X.Z.), den Xiangya sjukhus medel för Talent inledning (till XZ), National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 81572278 och 81272798 till XZ), bidrag från Kina “863” plan Projektet (Grant nr. 2014AA020610-1 till XZ), och Hunan Provincial Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 14JJ7008 till XZ). X.Z. tänkte sig konceptet för föreliggande manuskript, erhöll iTRAQ kvantitativa proteomikdata från mitokonsamproverna, skrev och reviderade manuskriptet, samordnade det relevanta arbetet och ansvarade för det ekonomiska stödet och motsvarande Arbete. H.L. förberett mitokonsamprover. S.Q. deltog i partiellt arbete. X. H. Z medverkade skriftligen och redigerade engelska språket. N.L. analyserade data från iTRAQ proteomik. Alla författare godkände det slutgiltiga manuskriptet.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
