Apresentado aqui é um protocolo para a entrega e o seguimento não invasores da pilha de haste do mesenchymal (MSC) em um modelo do rato de ferimento de cérebro traumático. As nanopartículas superparamagnéticas do óxido de ferro são empregadas como uma ponta de prova da imagem latente da ressonância magnética (MRI) para a rotulagem de MSC e o seguimento in vivo não invasor após a entrega intranasal usando mri em tempo real.
Terapias baseadas em células-tronco para lesões cerebrais, como lesão cerebral traumática (TCE), são uma abordagem promissora para ensaios clínicos. No entanto, obstáculos técnicos, como o parto invasivo de células e rastreamento com baixa eficiência de transplante, continuam sendo desafios na terapia translacional baseada em troncos. Este artigo descreve uma técnica emergente para rotulagem e rastreamento de células-tronco com base na rotulagem das células-tronco mesenchymal (MSCs) com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO), bem como entrega intranasal dos MSCs rotulados. Essas nanopartículas são isotiocianato fluorescenato (FITC) embutido e seguro para rotular os MSCs, que são posteriormente entregues aos cérebros de camundongos induzidos por TCE pela rota intranasal. Eles são então rastreados in vivo não invasivamente por ressonância magnética em tempo real (RM). As vantagens importantes desta técnica que combina SPIO para rotulagem celular e parto intranasal incluem (1) rastreamento de MSC não invasivo e invivo após a entrega por longos períodos de rastreamento(2) a possibilidade de múltiplos regimes de dosagem devido aos não invasivos rota de entrega de MSC, e (3) possíveis aplicações para seres humanos, devido à segurança do SPIO, natureza não invasiva do método de rastreamento celular por ressonância magnética e via de administração.
As células-tronco mesenchymal (MSC) são candidatos atraentes para terapias baseadas em células-tronco em tratamentos de distúrbios e lesões do sistema nervoso central (SNC) em humanos. Além disso, os MSCs têm sido utilizados como veículo para a entrega de proteínas terapêuticas nos locais de lesões1,2. Nos últimos anos, inovações promissoras foram desenvolvidas para estabelecer 1) novas rotas de entrega celular e 2) rastreamento de células para terapias baseadas em células-tronco de distúrbios do SNC. A entrega intranasal de células-tronco no cérebro depende da capacidade das células para contornar a placa cribriforme e entrar no bulbo olfativo parcialmente através de uma rota parenchymal3. A combinação de parto intranasal e a rotulagem de MSCs com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) representa uma abordagem promissora para aplicações clínicas de MSCs no tratamento de distúrbios do SNC, uma vez que as nanopartículas spio são sondas seguras para ressonância magnética (RM) e permitem rastreamento longitudinal sensível não invasivo de MSCs após a entrega por RS,4,5. Além disso, o parto intranasal é uma rota segura e não invasiva que permite a administração repetida dentro de um curto período de tempo.
Este artigo descreve uma técnica altamente sensível e não invasiva para rastrear MSCs na entrega pós-intranasal vivo em um modelo de lesão cerebral traumática (TCE) por camundongos, que emprega células com rótulospidespido e ressonância magnética. Uma vantagem importante da rotulagem spio é a detecção sensível de SPIO em tecido por ressonância magnética, o que torna possível rastrear as células de forma eficiente e não invasiva. As nanopartículas SPIO usadas aqui estão comercialmente disponíveis e marcadas com um fluotiocianato de fluorescena (FITC), que permite a detecção de SPIO em tecido sem imunocoloração ou processamento adicional. Além disso, é possível realizar rastreamento longitudinal em tempo real e investigar a biodistribuição dos MSCs entregues.
O protocolo descrito aqui representa procedimentos gerais para a rotulagem spio de MSCs e rastreamento de ressonância magnética de SPIO-rotulado scs pós-intranasal entrega. O protocolo permite a oportunidade de estudar a migração e a biodistribuição de MSCs após o parto in vivo no cérebro, utilizando um método não invasivo.
Os MSCs são candidatos atraentes para terapias baseadas em células-tronco para distúrbios e lesões do SNC devido à sua capacidade de secretar fatores tróficos que 1) desencadeiam processos neurorestauradores e 2) fornecem neuroproteção, devido aos seus efeitos anti-inflamatórios dentro da área de lesões9,10,11,12. Embora o rastreamento e detecção de Ressonância magnética de longo prazo de MSCs rotulados por SPIO possam ser limitados devido à diluição do SPIO intercelular com divisão celular, células rotuladas podem ser detectadas por até várias semanas após o transplante nos cérebros dos modelos animais13.
Também descrito aqui é o protocolo de rotulagem de MSCs com nanopartículas SPIO revestidas com dextran sem agentes de transfecção. Outros protocolos têm sido utilizados na literatura14,15,16. No entanto, em todos os casos, esses protocolos devem ser ajustados para o tipo celular, tamanho spio, tempo de incubação e concentração spio. MSCs foram mostrados para ter prejudicado o potencial de diferenciação condrógena, mas não a diferenciação adipogênica sobre SPIO rotulagem17. Portanto, é altamente recomendado que os ensaios de diferenciação sejam realizados antes da entrega de células-tronco para avaliar a influência do SPIO na potência de diferenciação das células-tronco. Em um estudo anterior, foi demonstrado que a rotulagem de MSC com o mesmo tipo spio e concentração usada no aqui não afetou a potência de diferenciação osteogênica ou adipogênica de MSCs6.
A rota intranasal da entrega terapêutica da pilha de haste para desordens e ferimentos de cérebro é uma aproximação prometedora para a aplicação clínica de pilhas de haste. No entanto, os mecanismos intrínsecos e moleculares que ditam os comportamentos das células-tronco na cavidade nasal permanecem obscuros. Embora a rota intranasal seja amplamente explorada para a entrega de pequenas moléculas, o tamanho e o comportamento de biodistribuição do caule terapêutico diferem das pequenas moléculas. O protocolo atual demonstra que os MSCs tendem a migrar para o local da lesão após a entrega intranasal.
Aqui, imagens ponderadas por T2*foram usadas para rastrear os MSCs rotulados por SPIO. Outros relatórios usaram imagens de eco gradiente. No entanto, artefatos de suscetibilidade são frequentemente observados em imagens de eco gradiente devido ao SPIO intercelular. No protocolo atual, a localização das áreas hipointensas que representam os MSCs rotulados pelo SPIO em imagens ponderadas por T2*foi a mesma que a localização do SPIO em seções cerebrais detectadas pelo exame histológico (Figura 3). Isso indica a sensibilidade adequada de imagens de eco de rotação ponderadas por T2*para rastreamento de MSC rotulado por SPIO no cérebro.
Em resumo, o protocolo descrito é benéfico para estudos in vivo do seguimento da pilha de haste de ferimentos e de desordens de cérebro. O rastreamento longitudinal de células-tronco in vivo tem sido tradicionalmente realizado sacrificando animais em vários pontos de tempo. O protocolo atual fornece uma abordagem não invasiva e eficiente para o parto e rastreamento de MSCs, o que representa um procedimento potencial para a terapia baseada em células-tronco para lesões cerebrais e distúrbios em ambientes clínicos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia Grants, Taiwan (MAIS 104-2923-B-038-004 -MY2, MAIS 107-2314-B-038-063, e mais 107-2314-B-038-042) e Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 e DP2-108-21121-01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |