Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.
Abstract
I cianobatteri sono un gruppo eterogeneo di organismi fotosintetici procyotici che possono essere geneticamente modificati per la produzione rinnovabile di beni industriali utili. I recenti progressi nella biologia sintetica hanno portato allo sviluppo di diversi toolkit di clonazione come CyanoGate, un sistema di clonazione modulare standardizzato per la costruzione di vettori plasmidi per la successiva trasformazione o trasferimento coniugale nei cianobatteri. Qui delineamo un metodo dettagliato per assemblare un vettore auto-replicante (ad esempio, portando una cassetta di espressione marcatore fluorescente) e il trasferimento coniugale del vettore nei ceppi cianobatterici Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus elongatus UTEX 2973. Inoltre, illustreremo come caratterizzare le prestazioni di una parte genetica (ad esempio, un promotore) utilizzando un lettore di lastre o una citometria di flusso.
Introduction
I cianobatteri sono batteri autotrofici che possono essere utilizzati per la biosintesi di un’ampia varietà di prodotti metabolici naturali ed eterologhi di alto valore1,2,3,4,5, 6. Diversi ostacoli devono ancora essere superati per espandere la loro redditività commerciale, in particolare, le rese relativamente scarse rispetto alle bio-piattaforme eterotrofiche (ad esempio, Escherichia coli e lievito)7. La recente espansione degli strumenti di ingegneria genetica disponibili e l’assorbimento del paradigma della biologia sintetica nella ricerca cianobatterica sta contribuendo a superare tali sfide e a sviluppare ulteriormente i cianobatteri come biofabbriche efficienti8, 9,10.
I principali approcci per introdurre il DNA nei cianobatteri sono la trasformazione, la coniugazione e l’elettroporazione. I vettori trasferiti ai cianobatteri mediante trasformazione o elettroporazione sono vettori “suicidio” (cioè vettori integrativi che facilitano la ricombinazione omologa), mentre i vettori auto-replicanti possono essere trasferiti ai cianobatteri trasformazione, coniugazione o elettroporazione. Per il primo, è disponibile un protocollo per le specie di modelli di ingegneria suscettibili alla trasformazione naturale11. Più recentemente, è stato sviluppato un kit di strumenti modulare di clonazione (MoClo) per cianobatteri chiamato CyanoGate che impiega un metodo standardizzato di assemblaggio vettoriale Golden Gate per l’ingegneria utilizzando la trasformazione naturale, l’elettroporazione o la coniugazione12.
Le tecniche di assemblaggio di tipo Golden Gate sono diventate sempre più popolari negli ultimi anni, e gli standard di assemblaggio e le librerie di parti sono ora disponibili per una varietà di organismi13,14,15,16 ,17. Golden Gate utilizza enzimi di restrizione IIS di tipo (ad esempio, BsaI, BpiI, BsmBI, Btg-I e AarI) e un’azione di accettatori e sbalzi univoci per facilitare l’assemblaggio gerarchico direzionale di sequenze multiple in una reazione di assemblaggio “one pot”. Gli enzimi di restrizione IIS di tipo Riconoscono una sequenza asimmetrica unica e tagliano una distanza definita dai loro siti di riconoscimento per generare un taglio sfalsato e “estremità appiccicosa” (in genere una sporgenza di 4 nucleotidi [NT]), che può essere successivamente sfruttata per guidare il DNA ordinato reazioni di assemblaggio15,18. Ciò ha facilitato lo sviluppo di grandi librerie di parti modulari di livello 0 (ad esempio, promotori, frame di lettura aperti e terminatori) definiti da una sintassi comune, come lo standard PhytoBricks19. Le parti di livello 0 possono quindi essere facilmente assemblate in cassette di espressione di livello 1, in seguito alle quali gli assiemi di ordine superiore più complessi (ad esempio, costrutti di espressione multigenetica) possono essere compilati in un vettore di accettazione scelto12,15. Un vantaggio chiave delle tecniche di assemblaggio di tipo Golden Gate è la loro amenabilità all’automazione in impianti ad alta produttività, come le fonderie di DNA20,21, che possono consentire il test di progetti sperimentali complessi che non può essere facilmente raggiunto con il lavoro manuale.
CyanoGate si basa sul sistema Plant MoClo12,15. Per incorporare una nuova parte in CyanoGate, la sequenza di parti deve prima essere addomesticata, cioè i siti di riconoscimento “illegali” per BsaI e BpiI devono essere rimossi. Nel caso di una parte codifica per un frame di lettura aperto (cioè una sequenza di codifica, CDS), i siti di riconoscimento possono essere interrotti generando mutazioni sinonimi nella sequenza (cioè, cambiando un codone in un’alternativa che codifica per lo stesso residuo di amminoacidi). Ciò può essere ottenuto da una varietà di approcci, che vanno dalla sintesi del DNA alla reazione a catena polimerasi (PCR) strategie basate sull’amplificazione come Gibson assembly22. A seconda dell’espressione host utilizzato, si dovrebbe fare attenzione a evitare l’introduzione di codoni rari che potrebbero inibire l’efficienza della traduzione23. La rimozione dei siti di riconoscimento nelle sequenze promotore e terminatore è in genere un’impresa più rischiosa, poiché le modifiche possono influire sulla funzione e la parte potrebbe non funzionare come previsto. Ad esempio, le modifiche ai siti di binding del fattore di trascrizione putativa o al sito di legame del ribosoma all’interno di un promotore potrebbero alterare la forza e la reattività all’induzione/repressione. Allo stesso modo, le modifiche alle caratteristiche strutturali principali del terminatore (ad esempio, il gambo ricco di GC, il loop e la coda poli-U) possono modificare l’efficienza di terminazione e l’espressione genica effetto24,25. Sebbene siano disponibili diverse risorse online per prevedere l’attività delle sequenze promotore e terminatore e informare se una mutazione proposta influirà sulle prestazioni26,27, questi strumenti sono spesso scarsi predittori di prestazioni in cianobatteri28,29,30 . Di conseguenza, si raccomanda ancora la caratterizzazione in vivo delle parti modificate per confermare l’attività. Per facilitare la clonazione delle sequenze recalcitranti, CyanoGate include un vettore dell’accettatore di clonazione a bassa copia basato sul vettore BioBrick pSB4K512,16,31. Inoltre, un portale “Design and Build” è disponibile attraverso la Edinburgh Genome Foundry per aiutare con la progettazione vettoriale (dab.genomefoundry.org). Infine, e soprattutto, CyanoGate include due progetti di vettori dell’accettatore di livello T (equivalenti ai vettori dell’acceleratore di livello 2)15 per l’introduzione di DNA nei cianobatteri utilizzando vettori suicidi o vettori di gamma ospite di ampio tipo in grado di auto-replicarsi in diverse specie cianobatteriche32,33,34.
Qui ci concentreremo sulla descrizione di un protocollo per la generazione di vettori auto-replicanti di livello T e la modificazione genetica di Synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 e S. elongatus UTEX 2973 in seguito) per coniugazione (noto anche come accoppiamento triparentale). Il trasferimento coniugale di DNA tra cellule batteriche è un processo ben descritto ed è stato precedentemente utilizzato per l’ingegneria di specie cianobatteriche, in particolare quelle che non sono naturalmente competenti, come S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. In breve, le colture cianobatteriche vengono incubate con un ceppo E. coli che trasporta il vettore da trasferire (il vettore “cargo”) e vettori (nella stessa deformazione E. coli o in ceppi aggiuntivi) per consentire la coniugazione (“mobilizer” vettori “helper”). Per il trasferimento coniugale sono necessarie quattro condizioni chiave: 1) il contatto diretto tra le cellule coinvolte nel trasferimento del DNA, 2) il vettore di carico deve essere compatibile con il sistema di coniugazione (cioè deve contenere un’origine adeguata del trasferimento (oriT), noto anche come bom (base di mobilità) sito), 3) una proteina di nicking del DNA (ad esempio, codificata dal gene della mafia) che intacca il DNA all’oriT per avviare il trasferimento a filamento del DNA nel cianobatterio deve essere presente ed esprimere vettori di carico o di supporto, e 4) il DNA trasferito non deve essere distrutto nel cianobatterio ricevente (cioè, deve essere resistente alla degradazione da, ad esempio, restrizione endonuclease attività)35,42. Affinché il vettore di carico persista, l’origine della replica deve essere compatibile con il cianobatterio ricevente per consentire l’auto-replicazione e la proliferazione nelle cellule figlie dopo la divisione. Per aiutare con le condizioni 3 e 4, diversi vettori helper sono disponibili attraverso Addgene e altre fonti commerciali che codificano per la mafia così come diverse metile per proteggere da endonucleasi nativi nel cianobatterio ospite43. In questo protocollo, la coniugazione è stata facilitata da un ceppo MC1061 E. coli che trasporta vettori mobilitatori e aiutanti pRK24 (www.addgeneorg/51950) e pRL528 (www.addgene.org/58495). Quando si scelgono i vettori da utilizzare per il trasferimento coniugale, occorre prestare attenzione. Ad esempio, nel kit CyanoGate il vettore cargo auto-replicante pPMQAK1-T codifica per una proteina Mob12. Tuttavia, pSEVA421-T non44e come tale, mob deve essere espresso da un vettore helper adatto. Anche i vettori utilizzati devono essere appropriati per l’organismo bersaglio. Ad esempio, un trasferimento efficiente dei coniugali in Anabaena sp. PCC 7120 richiede un vettore helper che protegga il vettore mobilitante dalla digestione (ad esempio, pRL623, che codifica per le tre metilasi AvaiM, Eco47iiM ed Ecot22iM)45, 46.
In questo protocollo viene ulteriormente descritto come caratterizzare le prestazioni delle parti (cioè promotori) con un marcatore fluorescente utilizzando un lettore di lastre o un citometro di flusso. I citometri di flusso sono in grado di misurare la fluorescenza su una singola base cellulare per una grande popolazione. Inoltre, i citometri di flusso consentono agli utenti di “portare” i dati acquisiti e rimuovere il rumore di fondo (ad esempio, dal particolato nella coltura o nella contaminazione). Al contrario, i lettori di placche acquisiscono una misurazione a fluorescenza aggregata di un dato volume di cultura, tipicamente in diversi pozzi replicanti. I principali vantaggi dei lettori di placche rispetto ai citometri includono il costo più basso, una maggiore disponibilità e in genere nessun requisito per software specializzato per l’analisi dei dati a valle. I principali inconvenienti dei lettori di placche sono la sensibilità relativamente più bassa rispetto ai citometri e potenziali problemi con la densità ottica delle culture misurate. Per le analisi comparative, i campioni di lettori di placche devono essere normalizzati per ogni pozzo (ad esempio, ad una misurazione della densità di coltura, generalmente presa come assorbimento alla densità ottica a 750 nm [OD750]), il che può portare a imprecisioni per i campioni troppo denso e/o non ben miscelato (ad es. quando è soggetto ad aggregazione o flocculazione).
Come panoramica, qui dimostriamo in dettaglio i principi di generazione di parti di livello 0, seguiti dall’assemblaggio gerarchico utilizzando il kit CyanoGate e la clonazione in un vettore adatto per il trasferimento coniugale. Dimostriamo quindi il processo di trasferimento coniugale, la selezione di ceppi transconiugici transconiugici che esprimono un marcatore fluorescente e la successiva acquisizione di dati di fluorescenza utilizzando un citometro di flusso o un lettore di lastre.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’assemblaggio Golden Gate presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di assemblaggio vettoriale, in particolare in termini di scalabilità20,21. Tuttavia, la configurazione del sistema Golden Gate in laboratorio richiede tempo per sviluppare una familiarità con le varie parti e le librerie vettoriali dell’accettatore e i processi di assemblaggio complessivi. È spesso necessaria un’attenta pianificazione per assiemi più complessi o quando si esegue un …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati alla rete PHYCONET PhyCONET Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) in Industrial Biotechnology and Bioenergy (NIBB) e all’Industrial Biotechnology Innovation Centre (IBioIC) per il sostegno finanziario. GARG, AASO e AP riconoscono il sostegno al finanziamento del programma BBSRC EASTBIO CASE PhD (numero di sovvenzione BB/M010996/1), del programma di dottorato Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog-a (CONACYT) e del programma di dottorato IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP), rispettivamente. Ringraziamo Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London) e Poul Eric Jensen e Julie Annemarie (Università di Copenaghen) per i contributi e i consigli sui vettori e sui protocolli plasmici.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
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