シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変
Summary
ここでは、i)CyanoGateモジュラークローニングツールキットを用いて自己複製ベクターを組み立てる方法を記述するプロトコルを提示し、ii)結合によりシアノバクテリア宿主にベクターを導入し、iii)を用いてトランスジェニックシアノバクテリア株を特徴付ける。プレートリーダーまたはフローサイトメトリー。
Abstract
シアノバクテリアは、有用な工業製品の再生可能な生産のために遺伝子組み換えすることができる原核生物の多様なグループです。合成生物学の最近の進歩は、シアノバクテリアへのその後の形質転換または共役転移のためのプラスミドベクターを構築するための標準化されたモジュラークローニングシステムであるCyanoGateなどのいくつかのクローニングツールキットの開発につながっています。ここでは、自己複製ベクター(例えば、蛍光マーカー発現カセットを運ぶ)を組み立てるための詳細な方法と、シアノバクテリア株シネキスシスプスPCC 6803またはシネココッカスへのベクターの共役移動の概要を説明します。エロンゲトゥスUTEX 2973。さらに、プレートリーダーまたはフローサイトメトリーを用いて遺伝的部分(例えばプロモーター)の性能を特徴付ける方法を概説する。
Introduction
シアノバクテリアは、多種多様な天然および異種値の代謝産物1、2、3、4、5の生合成に使用できる自己栄養性細菌である。 6.いくつかのハードルは、商業的生存率を拡大するためにまだ克服する必要があり、特に、異栄養性バイオプラットフォーム(例えば、大腸菌および酵母)に比べて比較的低い収率は7である。シアン細菌研究における利用可能な遺伝子工学ツールの最近の拡大と合成生物学パラダイムの取り込みは、このような課題を克服し、効率的なバイオファクトリーとしてシアノバクテリアをさらに開発するのに役立っています8,9、10。
シアノバクテリアにDNAを導入する主なアプローチは、形質転換、結合およびエレクトロポレーションである。形質転換またはエレクトロポレーションによってシアノバクテリアに移されるベクターは「自殺」ベクター(すなわち、相同組換えを促進する統合ベクター)であるのに対し、自己複製ベクターはシアノバクテリアに移すことができる。変換、結合またはエレクトロポレーション。前者の場合、自然変換11に適した工学モデル種に対してプロトコルが利用可能である。さらに最近では、CyanoGateと呼ばれるシアノバクテリア用モジュラークローニング(MoClo)ツールキットが開発されており、自然変換、エレクトロポレーションまたはコンジュゲーション12を用いたエンジニアリング用の標準化されたゴールデンゲートベクトル組み立て方法を採用している。
ゴールデンゲート型組み立て技術は近年ますます普及しており、組み立て規格や部品図書館は様々な生物に対して利用可能になりました13,14,15,16、17.ゴールデンゲートは、IIS制限酵素(例えば、BsaI、Bpi、BsmBI、BtgZIおよびAarI)とアクセプタとユニークなオーバーハングのスーツを使用して、「1つのポット」アセンブリ反応における複数の配列の方向性階層アセンブリを容易にします。IIS制限酵素は、一意の非対称配列を認識し、その認識部位から定義された距離を切断して、驚異的な「粘着性の端」カット(通常は4ヌクレオチド[NT]オーバーハング)を生成し、その後、順序付けられたDNAを駆動するために利用することができます組み立て反応15,18.これにより、PhytoBricks標準19のような一般的な構文によって定義されるモジュラーレベル0部品(例えば、プロモーター、オープンリーディングフレームおよびターミネータ)の大規模なライブラリの開発が容易になった。レベル0の部品は、レベル1式カセットに容易に組み立てることができ、その後、より複雑な高次アセンブリ(例えば、多遺伝子発現構造体)を選択12、15のアクセプタベクトルに組み込むことができる。ゴールデンゲート型組み立て技術の主な利点は、DNAファウンドリ20、21などの高スループット施設で自動化を行うことができるため、複雑な実験設計のテストが可能です。肉体労働では容易に達成できない。
シアノゲートは、確立されたプラントモクロシステム12、15に構築します。CyanoGateに新しい部品を組み込むには、まず部品シーケンスを家畜化する必要があります。オープンリーディングフレーム(すなわち、コード配列、CDS)の部品コードの場合、認識部位は、配列中の同義変異を生成することによって破壊され得る(すなわち、同じアミノ酸残基に対してコード化する代替にコドンを変更する)。これは、DNA合成からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅ベースの戦略(ギブソンアセンブリ22など)に至るまで、様々なアプローチによって達成することができる。使用される発現ホストに応じて、翻訳23の効率を阻害する可能性のある希少なコドンの導入を避けるように注意する必要があります。プロモーターおよびターミネータシーケンスの認識部位を削除することは、通常、変更が機能に影響を与える可能性があり、部品が期待どおりに動作しない可能性があるため、リスクの高い作業です。例えば、プロモーター内のプットアトリプション因子結合部位またはリボソーム結合部位への変更は、誘導/抑圧に対する強度および応答性を変化させ得る。同様に、主要なターミネータ構造特徴(例えば、GCリッチステム、ループおよびポリUテール)に対する改変は、終端効率および効果遺伝子発現24、25を変化させ得る。プロモーターおよびターミネータ配列の活性を予測し、提案された突然変異がパフォーマンス26、27に影響を与えるかどうかを通知するために、いくつかのオンラインリソースが利用可能ですが、これらのツールは、多くの場合、不十分な予測変数ですシアノバクテリアでの性能28,29,30.そのため、改変部品の生体内特性評価は、依然として活性を確認することをお勧めします。再計算配列のクローニングを支援するために、CyanoGateは、BioBrickベクターpSB4K512、16、31に基づく低コピークローニングアクセプタベクターを含む。さらに、エディンバラゲノムファウンドリーを通じて「デザインとビルド」ポータルを利用して、ベクターデザイン(dab.genomefoundry.org)を支援します。最後に、最も重要なのは、CyanoGateには、自殺ベクターを用いてシアノバクテリアにDNAを導入するための2つのレベルTアクセプタベクター設計(レベル2アクセプタベクターに相当)15、または自己複製が可能な広範な宿主範囲ベクターが含まれています。いくつかのシアノバクテリア種で 32,33,34.
ここでは、レベルT自己複製ベクターを生成するためのプロトコルとシネコシスティスPCC 6803とシネココッカス・エロンガトゥスUTEX 2973(シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンガトゥス)の遺伝子改変を記述することに焦点を当てます。UTEX 2973以下)により、活用(トライペアレンタル交配とも呼ばれる)。細菌細胞間のDNAの共役移動は、よく記述されたプロセスであり、以前にシアノバクテリア種の工学に使用されてきましたが、特にS.エロンガトゥスUTEX 297335のような自然に有能でないもの、 36、37、38、39、40、41 .簡単に言えば、シアノバクテリア培養物は、移送されるベクター(「貨物」ベクター)とベクター(同じ大腸菌株または追加株のいずれか)を運ぶ大腸菌株をインキュベートして、コンジュゲーション(「モビライザー」)を可能にします。および “ヘルパー” ベクター)。共役転移が起こるためには4つの重要な条件が必要である:1)DNA移動に関与する細胞間の直接接触、2)貨物ベクターはコンジュゲーションシステムと互換性がなければならない(すなわち、適切な伝達起源(oriT)が含まれている必要があります。また、BOM(移動度の基礎)部位として知られ、3)DNAニッキングタンパク質(例えば、暴徒遺伝子によってコードされる)は、DNAをシアノバクテリウムへの一本鎖移動を開始するためにオリットでDNAをニックし、発現しなければならない貨物またはヘルパーベクターのいずれかから、および4)転写されたDNAは、レシピエントシアノバクテリウム内で破壊されてはならない(すなわち、例えば、制限エンドヌクレアーゼ活性によって分解に対して耐性でなければならない)35、42。貨物ベクターが持続するためには、複製の起源がレシピエントシアノバクテリウムと互換性があり、自己複製および後の分裂後の娘細胞への増殖を可能にする必要があります。条件3および4を支援するために、いくつかのヘルパーベクターは、ホストシアノバクテリウム43内の天然のエンドヌクレアーゼから保護するために、暴徒のためにコードするAddgeneおよび他の商業ソースおよびいくつかのメチルアーゼを介して利用可能である。このプロトコルでは、コビライザーおよびヘルパーベクターpRK24(www.addgeneorg/51950)およびpRL528(www.addgene.org/58495)をそれぞれ運ぶMC1061大腸菌株によって結合が促進された。共役転写に使用するベクターを選択する際には注意が必要です。例えば、CyanoGateキットでは、自己複製貨物ベクトルpPMQAK1-Tがモブタンパク質12に対してコード化される。ただし、pSEVA421-Tは44ではなく、そのため、mobは適切なヘルパーベクトルから発現されなければならない。使用されるベクターは、標的生物にも適している必要があります。例えば、Anabaena sp. PCC 7120における効率的な共役伝達は、消化からモビライザーベクトルを保護するヘルパーベクターを必要とします(例えば、pRL623は、3つのメチルアベイム、Eco47iiMおよびEcot22iM)45のためにコードする、 46.
このプロトコルでは、プレートリーダーまたはフローサイトメーターを使用して蛍光マーカーを使用して部品(すなわちプロモーター)の性能を特徴付ける方法をさらに概説します。フローサイトメーターは、大規模な集団に対して単一の細胞ベースで蛍光を測定することができます。さらに、フローサイトメーターは、ユーザーが取得したデータを「ゲート」し、バックグラウンドノイズ(例えば、培養または汚染中の粒子状物質から)を除去することを可能にします。対照的に、プレートリーダーは、所定の培養量の凝集蛍光測定を取得し、典型的には複数の複製井戸で得る。キロメートル計を超えるプレートリーダーの主な利点は、低コスト、高可用性、通常はダウンストリームデータ分析のためのスペシャリストソフトウェアの必要性がないことです。プレートリーダーの主な欠点は、細胞計に比べて感度が比較的低く、測定された培養物の光学密度に関する潜在的な問題です。比較分析では、プレートリーダーサンプルを各ウェル(例えば、培養密度の測定に、通常750nm[OD750]の光学密度での吸光度として取られる)を正規化する必要があり、これはあまりにも不正確なサンプルの不正確さにつながる可能性があります。高密度および/または十分に混合されていない(例えば、凝集または凝集が起こりやすい場合)。
概要として、ここではレベル0部品を生成し、続いてCyanoGateキットを使用して階層アセンブリを作成し、共役転送に適したベクトルにクローニングするという原則を詳細に示します。次に、共役伝達プロセス、蛍光マーカーを発現する軸経共役株の選択、およびフローサイトメーターまたはプレートリーダーを用いた蛍光データの取得について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゴールデンゲートアセンブリは、他のベクトルアセンブリメソッドと比較して、特にスケーラビリティ20、21の点でいくつかの利点があります。それにもかかわらず、ラボでゴールデンゲートシステムを設定するには、さまざまな部品とアクセプタベクトルライブラリと全体的なアセンブリプロセスに精通する時間が必要です。多くの場合、より複?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、産業バイオテクノロジー・バイオエネルギー研究評議会(BBSRC)ネットワークと産業バイオテクノロジーイノベーションセンター(IBioIC)の資金援助に感謝しています。GARG、AASO、APは、BBSRC EASTBIO CASE PhDプログラム(助成金番号BB/M010996/1)、コンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(CONACYT)博士課程、およびIBioIC-BBSRC共同トレーニングパートナーシップ(CTP)博士プログラムからの資金援助を認め、それぞれ。コンラッド・ムリノー(ロンドンのクイーン・メアリー大学)とポール・エリック・ジェンセンとジュリー・アンネマリー・ゼドラー(コペンハーゲン大学)は、プラスミドベクターとプロトコルの貢献とアドバイスに感謝します。
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
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