Genetisk modifiering av cyanobakterier genom konjugering med hjälp av den modulbaserade klonings verktygslådan Cyanogat
Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver hur man i) monterar en självreplikerande vektor med hjälp av CyanoGate Modular kloning Toolkit, II) introducera vektorn i en cyanobakterial värd genom konjugering, och III) karakterisera transgena cyanobakterier-stammar med hjälp av en Plattläsare eller flödescytometri.
Abstract
Cyanobakterier är en mångskiftande grupp av prokaryotiska fotosyntetiska organismer som kan modifieras genetiskt för förnybar produktion av nyttiga industriråvaror. De senaste framstegen inom syntetisk biologi har lett till utveckling av flera klonings verktyg som CyanoGate, ett standardiserat modulärt klonings system för att bygga plasmid-vektorer för efterföljande omvandling eller konjugal överföring till cyanobakterier. Här beskriver vi en detaljerad metod för att montera en självreplikerande vektor (t. ex. med en fluorescerande markör uttrycks kassett) och äktenskapliga överföring av vektorn i cyanobakterial stammar synechocystis SP. PCC 6803 eller synechococcus elongatus utex 2973. Dessutom skisserar vi hur man karakteriserar utförandet av en genetisk del (t. ex. en promotor) med hjälp av en Plattläsare eller flödescytometri.
Introduction
Cyanobakterier är autotrofiska bakterier som kan användas för biosyntesen av en mängd olika naturliga och heterologösa, metaboliska produkter med högt värde1,2,3,4,5, 6. Flera hinder måste fortfarande övervinnas för att utvidga sin kommersiella lönsamhet, framför allt de relativt dåliga avkastningen jämfört med heterotrofiska bioplattformar (t. ex., Escherichia coli och jäst)7. Den senaste utvidgningen av tillgängliga gentekniska verktyg och upptaget av det syntetiska biologiska paradigmet inom cyanobakteriell forskning bidrar till att övervinna sådana utmaningar och vidareutveckla cyanobakterier som effektiva biogödsel8, 9,10.
De viktigaste metoderna för att införa DNA i cyanobakterier är omvandling, konjugering och elektroporation. De vektorer som överförs till cyanobakterier genom omvandling eller elektroporation är “självmord” vektorer (dvs. integrativa vektorer som underlättar homolog rekombination), medan självreplikerande vektorer kan överföras till cyanobakterier genom omvandling, konjugering eller elektroporation. För de förstnämnda finns ett protokoll för tekniska modell arter som kan vara mottagliga för naturlig omvandling11. På senare tid, en modulär kloning (MoClo) Toolkit för cyanobakterier kallas Cyanogat har utvecklats som sysselsätter en standardiserad Golden Gate Vector monteringsmetod för teknik med hjälp av naturliga omvandling, elektroporation eller konjugation12.
Golden Gate-typ monteringstekniker har blivit alltmer populära under de senaste åren, och montering standarder och del bibliotek finns nu tillgängliga för en mängd olika organismer13,14,15,16 ,17. Golden Gate använder typ IIS restriktioner enzymer (t. ex., BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI och AarI) och en kostym av acceptorer och unika överhäng för att underlätta riktad hierarkisk montering av flera sekvenser i en “One Pot” församling reaktion. Typ IIS begränsning enzymer erkänna en unik asymmetrisk sekvens och skär ett definierat avstånd från deras erkännande platser för att generera en vacklade, “klibbiga slutet” klippa (typiskt en 4 nukleotid [NT] överhäng), som senare kan utnyttjas för att köra beställt DNA Monterings reaktioner15,18. Detta har underlättat utvecklingen av stora bibliotek av modulära nivå 0-delar (t. ex. projektansvariga, öppna Läs ramar och Terminatorer) som definieras av en gemensam syntax, såsom PhytoBricks standard19. Nivå 0 delar kan sedan lätt monteras i nivå 1 uttrycks kassetter, varefter mer komplexa högre ordning församlingar (t. ex., multigene uttryck konstruktioner) kan byggas i en acceptor vektor val12,15. En viktig fördel med Golden Gate-typ monteringstekniker är deras mottaglighet för automatisering vid hög genomströmning anläggningar, såsom DNA gjuterier20,21, som kan möjliggöra testning av komplexa experimentella konstruktioner som lätt kan uppnås genom manuellt arbete.
Cyanogat bygger på den etablerade anläggningen moclo system12,15. För att införliva en ny del i Cyanogat måste dels sekvensen först tämjas, d.v.s. “olagliga” igenkännings platser för BsaI och BpiI måste avlägsnas. I fråga om en del kodning för en öppen läsbild (dvs en kodning sekvens, CD-skivor), erkännande platser kan störas genom att generera synonyma mutationer i sekvensen (dvs., ändra en kodon till ett alternativ som kodar för samma aminosyra rester). Detta kan uppnås genom en mängd olika metoder, allt från DNA-syntes till polymeras kedjereaktion (PCR) amplifiering-baserade strategier såsom Gibson Assembly22. Beroende på uttrycket värd som används, försiktighet bör iakttas för att undvika införandet av sällsynta kodons som kan hämma effektiviteten av översättningen23. Ta bort erkännande platser i promotorn och Terminator sekvenser är typiskt en mer riskfyllda strävan, som ändringar kan påverka funktionen och delen kanske inte fungerar som förväntat. Till exempel kan ändringar av bindnings platser för förmodade transkriptionsfaktorer eller den ribosom bindnings platsen inom en promotor förändra styrka och reaktionsförmåga till induktion/förtryck. Likaså ändringar av viktiga Terminator strukturella egenskaper (t. ex. GC Rich Stem, loop och Poly-U svans) kan ändra terminering effektivitet och effekt genuttryck24,25. Även om flera online-resurser är tillgängliga för att förutsäga aktiviteten av promotorn och Terminator sekvenser, och informera om en föreslagen mutation kommer att påverka prestanda26,27, dessa verktyg är ofta dåliga prediktorer för prestanda i cyanobakterier28,29,30.. Som sådan, in vivo karakterisering av modifierade delar rekommenderas fortfarande att bekräfta aktivitet. För att hjälpa till med kloning av motsträvare sekvenser, cyanogate innehåller en låg kopia kloning acceptor vektor baserad på biobrick Vector pSB4K512,16,31. Dessutom är en “design och bygga” portal tillgänglig via Edinburgh Genome Foundry för att hjälpa till med Vector design (dab.genomefoundry.org). Slutligen, och viktigast av allt, inkluderar Cyanogat två nivå T acceptor vektor konstruktioner (motsvarande nivå 2 acceptor vektorer)15 för att införa DNA i cyanobakterier med hjälp av självmords vektorer, eller breda vektorer för värd-Range som kan själv replikering i flera cyanobakteriella arter32,33,34.
Här kommer vi att fokusera på att beskriva ett protokoll för att generera nivå T självreplikerande vektorer och genetisk modifiering av Synechocystis pcc 6803 och Synechococcus elongatus Utex 2973 (synechocystis PCC 6803 och S. elongatus Utex 2973 hädanefter) genom konjugering (även känd som Tri-Parental parning). Conjugal överföring av DNA mellan bakterieceller är en väl beskriven process och har tidigare använts för tekniska cyanobakteriella arter, särskilt de som inte är naturligt kompetenta, såsom S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. I korthet, cyanobakterial kulturer inkuberas med en E. coli stam transporterar vektorn som skall överföras (“Last” vektor) och vektorer (antingen i samma E. coli stam eller i ytterligare stammar) för att möjliggöra konjugering (“mobilizer” och “hjälpare” vektorer). Fyra viktiga villkor krävs för att den äktenskapliga överföringen ska ske: 1) direkt kontakt mellan celler som är involverade i DNA-överföring, 2) Last vektorn måste vara förenlig med konjugeringssystemet (dvs. det måste innehålla ett lämpligt ursprung för överföring (Orit). även känd som en BOM (grund för rörlighet) plats), 3) ett DNA Hack protein (t. ex. kodas av Mob genen) att Nicks DNA vid Orit att initiera enkelsträngad överföring av DNA i Cyanobakterium måste vara närvarande och uttryckt från antingen lasten eller hjälp vektorer, och 4) den överförda DNA får inte förstöras i mottagaren Cyanobakterium (dvs måste vara resistenta mot nedbrytning av, till exempel, begränsning Endonuklease aktivitet)35,42. För att Last vektorn ska bestå måste replikens ursprung vara kompatibelt med mottagaren Cyanobakterium för att möjliggöra själv replikering och spridning till dotter cells post division. Till stöd med villkor 3 och 4, flera Helper vektorer är tillgängliga via Addgene och andra kommersiella källor som kodar för Mob samt flera metylaser för att skydda från infödda endonukleaser i värd Cyanobakterium43. I detta protokoll, konjugation underlättades av en MC1061 E. coli stam bärande person och Helper vektorer pRK24 (www. addgeneorg/51950) och pRL528 (www.addgene.org/58495), respectively. Försiktighet måste iakttas vid val av vektorer som skall användas föräktenskapliga överföring. Till exempel, i CyanoGate kit självreplikerande Cargo Vector pPMQAK1-T kodar för en Mob protein12. Men pSEVA421-T inte44, och som sådan, Mob måste uttryckas från en lämplig hjälpare vektor. De vektorer som används bör också vara lämpliga för målorganismen. Till exempel kräver effektiv konjugal överföring i Anabaena SP. PCC 7120 en hjälp vektor som skyddar person vektorn mot matsmältningen (t. ex. pRL623, som kodar för de tre metylaser avaim, Eco47iiM och Ecot22iM)45, 46.
I detta protokoll beskriver vi vidare hur man karakteriserar utförandet av delar (dvs. projektansvariga) med en fluorescerande markör med hjälp av en Plattläsare eller en flödescytometer. Flödescytometrar kan mäta fluorescens på en enda cellbasis för en stor population. Dessutom tillåter flödescytometrar användare att “utfärda utegångsförbud för” de förvärvade uppgifterna och ta bort bakgrundsbrus (t. ex. från partiklar i kulturen eller föroreningen). Däremot får plattläsarna en sammanlagd fluorescensmätning av en given volym kultur, vanligtvis i flera replikbrunnar. De viktigaste fördelarna med Plattläsare över cytometrar är lägre kostnad, högre tillgänglighet och vanligtvis inga krav på specialist programvara för nedströms dataanalyser. De huvudsakliga nackdelarna med Plattläsare är den relativt lägre känsligheten jämfört med cytometrar och potentiella problem med den optiska densiteten hos uppmätta kulturer. För jämförande analyser måste prov på Plattläsare normaliseras för varje brunn (t. ex. till en mätning av Odlingstätheten, som normalt tas som absorbans vid den optiska densiteten vid 750 nm [OD750]), vilket kan leda till felaktigheter för prover som är för täta och/eller inte väl blandade (t. ex. när de är benägna att aggregering eller flocympning).
Som en översikt, här visar vi i detalj principerna för att generera nivå 0 delar, följt av hierarkisk församling med hjälp av CyanoGate kit och kloning i en vektor som lämpar sig föräktenskapliga överföring. Vi visar sedan den äktenskapliga transfer processen, val av axenic transkonjugant stammar som uttrycker en fluorescerande markör, och efterföljande förvärv av fluorescensdata med hjälp av en flödescytometer eller en Plattläsare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Golden Gate Assembly har flera fördelar jämfört med andra vektor monteringsmetoder, särskilt när det gäller skalbarhet20,21. Ändå kräver inrättandet av Golden Gate-systemet i ett labb tid för att utveckla en förtrogenhet med de olika delarna och acceptor vektor bibliotek och övergripande monteringsprocesser. Noggrann planering behövs ofta för mer komplexa sammansättningar eller när man utför ett stort antal komplexa sammansättningar parallellt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma för PHYCONET bioteknik och biologisk vetenskap forskningsrådet (BBSRC) nätverk inom industriell bioteknik och bioenergi (NIBB) och Industrial Biotechnology innovation Centre (IBioIC) för ekonomiskt stöd. GARG, AASO och AP erkänner finansiering stöd från BBSRC EASTBIO fall PhD program (Grant Number BB/M010996/1), den Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) doktorandprogrammet, och IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP) doktorandprogrammet, Respektive. Vi tackar Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), och Poul Eric Jensen och Julie Anne Marie Zita Zedler (Köpenhamns universitet) för plasmid Vector och protokoll bidrag och råd.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
References
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
- Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
- Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
- Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
- Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
- Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
- Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
- Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
- Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
- Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
- Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
- Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
- Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
- Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
- Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
- Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
- Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
- Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
- Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
- Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
- Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
- Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
- Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
- Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
- Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
- Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
- Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
- Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
- Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
- Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
- Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
- Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
- Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
- Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
- Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
- Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
- Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
- Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
- Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
