Modification génétique des cyanobactéries par conjugaison à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire CyanoGate
Summary
Ici, nous présentons un protocole décrivant comment i) assembler un vecteur auto-réplicant à l’aide de la boîte à outils modulaire de clonage CyanoGate, ii) introduire le vecteur dans un hôte cyanobactérieparpare par conjugaison, et iii) caractériser les souches transgéniques cyanobactéries en utilisant un lecteur de plaque ou cytométrie de flux.
Abstract
Les cyanobactéries sont un groupe diversifié d’organismes photosynthétiques procaryotiques qui peuvent être génétiquement modifiés pour la production renouvelable de produits industriels utiles. Les progrès récents de la biologie synthétique ont mené au développement de plusieurs boîtes à outils de clonage telles que CyanoGate, un système de clonage modulaire standardisé pour la construction de vecteurs plasmides pour la transformation ultérieure ou le transfert conjugal en cyanobactéries. Ici, nous énoncons une méthode détaillée pour l’assemblage d’un vecteur auto-réplication (par exemple, portant une cassette d’expression marqueur fluorescent) et le transfert conjugal du vecteur dans les souches cyanobactériennes Synechocystis sp. PCC 6803 ou Synechococcus elongatus UTEX 2973. En outre, nous décrivons comment caractériser la performance d’une partie génétique (par exemple, un promoteur) à l’aide d’un lecteur de plaque ou d’une cytométrie de flux.
Introduction
Les cyanobactéries sont des bactéries autotrophes qui peuvent être utilisées pour la biosynthèse d’une grande variété de produits métaboliques naturels et hétérologues de haute valeur1,2,3,4 ,5, 6. Plusieurs obstacles doivent encore être surmontés pour accroître leur viabilité commerciale, notamment les rendements relativement faibles par rapport aux bio-plateformes hétérotrophes (p. ex. Escherichia coli et levure)7. L’expansion récente des outils de génie génétique disponibles et l’utilisation du paradigme de la biologie synthétique dans la recherche cyanobactérienne aide à surmonter ces défis et à développer davantage les cyanobactéries comme biousines efficaces8, 9,10.
Les principales approches pour introduire l’ADN dans les cyanobactéries sont la transformation, la conjugaison et l’électroporation. Les vecteurs transférés aux cyanobactéries par transformation ou électroporation sont des vecteurs « suicidaires » (c.-à-d. vecteurs intégratifs qui facilitent la recombinaison homologue), tandis que les vecteurs auto-répliquants peuvent être transférés aux cyanobactéries par transformation, conjugaison ou électroporation. Pour le premier, un protocole est disponible pour les espèces modèles d’ingénierie propices à la transformation naturelle11. Plus récemment, une boîte à outils modulaire de clonage (MoClo) pour les cyanobactéries appelée CyanoGate a été développée qui emploie une méthode standardisée d’assemblage vectoriel Golden Gate pour l’ingénierie utilisant la transformation naturelle, l’électroporation ou la conjugaison12.
Les techniques d’assemblage de type Golden Gate sont devenues de plus en plus populaires ces dernières années, et les normes d’assemblage et les bibliothèques de parties sont maintenant disponibles pour une variété d’organismes13,14,15,16 ,17. Golden Gate utilise des enzymes de restriction de type IIS (par exemple, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI et AarI) et un costume d’accepteurs et de surplombs uniques pour faciliter l’assemblage hiérarchique directionnel de séquences multiples dans une réaction d’assemblage « un pot ». Les enzymes de restriction de type IIS reconnaissent une séquence asymétrique unique et coupent une distance définie par rapport à leurs sites de reconnaissance pour générer une coupe décalée et « collante » (généralement un surplomb de 4 nucléotides [NT]), qui peut être ensuite exploitée pour conduire l’ADN ordonné réactions d’assemblage15,18. Cela a facilité le développement de grandes bibliothèques de pièces modulaires de niveau 0 (p. ex., promoteurs, cadres de lecture ouverts et terminaisons) définies par une syntaxe commune, comme la norme PhytoBricks19. Les pièces de niveau 0 peuvent alors être facilement assemblées dans des cassettes d’expression de niveau 1, après quoi des assemblages d’ordre supérieur plus complexes (p. ex., des constructions d’expression multigène) peuvent être construits dans un vecteur d’accepteur de choix12,15. Un avantage clé des techniques d’assemblage de type Golden Gate est leur agréabilité à l’automatisation dans les installations à haut débit, telles que les fonderies d’ADN20,21, qui peuvent permettre l’essai de conceptions expérimentales complexes qui ne peut pas facilement être atteint par le travail manuel.
CyanoGate s’appuie sur le système Plant MoClo établi12,15. Pour incorporer une nouvelle pièce dans CyanoGate, la séquence de pièce doit d’abord être domestiquée, c’est-à-dire que les sites de reconnaissance « illégaux » pour BsaI et BpiI doivent être supprimés. Dans le cas d’une pièce codant pour un cadre de lecture ouvert (c.-à-d. une séquence de codage, CDS), les sites de reconnaissance peuvent être perturbés en générant des mutations synonymes dans la séquence (c.-à-d., en changeant un codon à une alternative qui code pour le même résidu d’acide aminé). Ceci peut être réalisé par une variété d’approches, allant de la synthèse de l’ADN à la réaction en chaîne de polymérase (PCR) des stratégies basées sur l’amplification telles que l’assemblage Gibson22. Selon l’expression hôte utilisé, il faut prendre soin d’éviter l’introduction de codons rares qui pourraient entraver l’efficacité de la traduction23. Supprimer les sites de reconnaissance dans les séquences de promoteur et de terminaison est généralement une entreprise plus risquée, car les modifications peuvent affecter la fonction et la pièce pourrait ne pas fonctionner comme prévu. Par exemple, les changements apportés aux sites de liaison des facteurs de transcription putatifs ou au site de liaison des ribosomes au sein d’un promoteur pourraient modifier la force et la réactivité à l’induction/répression. De même, les modifications apportées aux caractéristiques structurales clés du terminateur (p. ex., la tige riche en GC, la boucle et la queue poly-U) peuvent modifier l’efficacité de terminaison et l’expression des gènesd’effet 24,25. Bien que plusieurs ressources en ligne soient disponibles pour prédire l’activité des séquences de promoteur et de terminaison, et indiquer si une mutation proposée aura un impact sur les performances26,27, ces outils sont souvent de mauvais prédicteurs de performance en cyanobactéries28,29,30.. En tant que tel, la caractérisation in vivo des pièces modifiées est toujours recommandée pour confirmer l’activité. Pour aider au clonage des séquences récalcitrantes, CyanoGate inclut un vecteur d’accepteur de clonage à faible copie basé sur le vecteur BioBrick pSB4K512,16,31. En outre, un portail “Design and Build” est disponible par l’intermédiaire de la Fonderie du génome d’Édimbourg pour aider à la conception vectorielle (dab.genomefoundry.org). Enfin, et surtout, CyanoGate comprend deux conceptions vectorielles d’accepteur de niveau T (équivalentes aux vecteurs d’accepteur de niveau 2)15 pour l’introduction de l’ADN dans les cyanobactéries à l’aide de vecteurs de suicide, ou de larges vecteurs de portée hôte capables d’autoréplication dans plusieurs espèces cyanobactériennes32,33,34.
Ici, nous allons nous concentrer sur la description d’un protocole pour générer des vecteurs d’auto-reproduction de niveau T et la modification génétique de Synechocystis PCC 6803 et Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 et S. elongatusus UTEX 2973 ci-après) par conjugaison (également connu sous le nom d’accouplement triparental). Le transfert conjugal de l’ADN entre les cellules bactériennes est un processus bien décrit et a été précédemment employé pour l’ingénierie des espèces cyanobactériennes, en particulier ceux qui ne sont pas naturellement compétents, tels que S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. En bref, les cultures cyanobactériennes sont incubées avec une souche E. coli transportant le vecteur à transférer (le vecteur de « cargaison ») et des vecteurs (soit dans la même souche E. coli ou dans des souches supplémentaires) pour permettre la conjugaison (« mobilisateur » et les vecteurs d’aide). Quatre conditions clés sont requises pour que le transfert conjugal se produise : 1) le contact direct entre les cellules impliquées dans le transfert d’ADN, 2) le vecteur de cargaison doit être compatible avec le système de conjugaison (c.-à-d., il doit contenir une origine appropriée de transfert (oriT), également connu sous le nom de site bom (base de la mobilité), 3) une protéine de nicking d’ADN (par exemple, codée par le gène de la mafia) qui entaille l’ADN à l’oriT pour initier le transfert à brin unique de l’ADN dans le cyanobacterium doit être présent et exprimé des vecteurs de cargaison ou d’aide, et 4) l’ADN transféré ne doit pas être détruit dans le cyanobacterium du receveur (c.-à-d. qu’il doit être résistant à la dégradation par, par exemple, l’activité d’endonucléase de restriction)35,42. Pour que le vecteur de cargaison persiste, l’origine de la réplication doit être compatible avec le cyanobacterium du destinataire pour permettre l’auto-réplication et la prolifération dans les cellules filles après la division. Pour aider avec les conditions 3 et 4, plusieurs vecteurs d’aide sont disponibles par Addgene et d’autres sources commerciales qui codent pour la foule ainsi que plusieurs méthylases pour se protéger contre les endonucabales indigènes dans le cyanobacteriumhôte 43. Dans ce protocole, la conjugaison a été facilitée par une souche MC1061 E. coli transportant des vecteurs mobilisateurs et d’aide pRK24 (www.addgeneorg/51950) et pRL528 (www.addgene.org/58495), respectivement. Il faut prendre soin de choisir les vecteurs à utiliser pour le transfert conjugal. Par exemple, dans le kit CyanoGate, le vecteur de cargaison auto-réplérant pPMQAK1-T code pour une protéine Mob12. Cependant, pSEVA421-T ne44, et en tant que tel, la foule doit être exprimée à partir d’un vecteur d’aide approprié. Les vecteurs utilisés doivent également être appropriés à l’organisme cible. Par exemple, le transfert conjugal efficace dans Anabaena sp. PCC 7120 nécessite un vecteur d’aide qui protège le vecteur mobilisateur contre la digestion (p.p.p. pRL623, qui code pour les trois méthylases AvaiM, Eco47iiM et Ecot22iM)45, 46.
Dans ce protocole, nous décrivons en outre comment caractériser la performance des pièces (c.-à-d. les promoteurs) avec un marqueur fluorescent à l’aide d’un lecteur de plaque ou d’un cytomètre de débit. Les cytomètres de débit sont capables de mesurer la fluorescence sur une seule base cellulaire pour une grande population. De plus, les cytomètres de débit permettent aux utilisateurs de « saisir » les données acquises et d’éliminer le bruit de fond (p. ex., des particules dans la culture ou la contamination). En revanche, les lecteurs de plaques acquièrent une mesure de fluorescence agrégée d’un volume donné de culture, généralement dans plusieurs puits de repli. Les principaux avantages des lecteurs de plaques par rapport aux cytomètres comprennent le coût inférieur, une disponibilité plus élevée et généralement aucune exigence de logiciels spécialisés pour les analyses de données en aval. Les principaux inconvénients des lecteurs de plaques sont la sensibilité relativement plus faible par rapport aux cytomètres et les problèmes potentiels avec la densité optique des cultures mesurées. Pour les analyses comparatives, les échantillons de lecteurs de plaques doivent être normalisés pour chaque puits (p. ex., pour mesurer la densité de culture, généralement prise comme absorption à la densité optique à 750 nm [OD750]),ce qui peut conduire à des inexactitudes pour les échantillons qui sont trop dense et/ou pas bien mélangé (p. ex., lorsqu’il est sujet à l’agrégation ou à la flocculation).
En résumé, nous démontrons ici en détail les principes de génération de pièces de niveau 0, suivies d’un assemblage hiérarchique à l’aide du kit CyanoGate et d’un clonage en un vecteur adapté au transfert conjugal. Nous démontrons alors le processus conjugal de transfert, la sélection des souches transconjugales axeniques exprimant un marqueur fluorescent, et l’acquisition ultérieure des données de fluorescence utilisant un cytomètre de flux ou un lecteur de plaque.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’assemblage du Golden Gate présente plusieurs avantages par rapport à d’autres méthodes d’assemblage vectoriel, notamment en termes d’évolutivité20,21. Néanmoins, la mise en place du système Golden Gate dans un laboratoire nécessite du temps pour développer une familiarité avec les différentes parties et les bibliothèques vectorielles acceptor et les processus d’assemblage global. Une planification minutieuse est souvent nécessaire pour des assembla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants au Réseau de biotechnologie et de recherche en sciences biologiques (BBSRC) du PHYCONET Biotechnology and Biological Research Council (BBSRC) en biotechnologie industrielle et en bioénergie (NIBB) et au Centre d’innovation en biotechnologie industrielle (IBioIC) pour leur soutien financier. GARG, AASO et AP reconnaissent le soutien financier du programme de doctorat BBSRC EASTBIO CASE (numéro de subvention BB/M010996/1), du programme de doctorat Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) et du programme de doctorat IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP), respectivement. Nous remercions Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), et Poul Eric Jensen et Julie Annemarie Zita Zedler (Université de Copenhague) pour les contributions et les conseils du plasmique vectoriel et du protocole.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
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