毛因神经发生期间诺奇信号动力学的实时生物发光成像
Summary
神经干细胞/祖细胞表现出Notch信号分量的各种表达动力学，导致细胞事件的不同结果。这种动态表达可以通过实时监测，而不是静态分析来显示，使用高度敏感的生物发光成像系统，能够可视化基因表达的快速变化。
Abstract
Notch信号通过细胞-细胞相互作用调节神经干细胞/祖细胞的维持。Notch 信令的组件表现出动态表达式。槽口信号效应器 Hes1 和 Notch 配体增量类似 1 （Dll1） 在神经茎/祖细胞中以振荡方式表示。由于这些基因的振荡表达周期很短（2小时），因此很难监测它们的循环表达。为了检查基因表达或蛋白质动力学的这种快速变化，需要快速响应报告器。由于其快速成熟动力学和高灵敏度，生物发光报明酶适用于监测活细胞中快速的基因表达变化。我们使用不稳定的荧光素酶报告器来监测促进者活动，使用荧光素酶融合报告器在单个细胞分辨率下可视化蛋白质动力学。这些生物发光记者显示快速周转，并产生非常微弱的信号;因此，我们开发了一个高度敏感的生物发光成像系统来检测这种微弱的信号。这些方法使我们能够监测活细胞和组织的各种基因表达动力学，这是帮助了解实际细胞状态的重要信息。
Introduction
哺乳动物的大脑由大量不同类型的神经元和胶质细胞组成。所有细胞都是从神经干细胞/祖细胞（NPC）生成的，这些细胞首先增殖以扩大其数量，然后开始分化成神经元，最后产生胶质细胞1、2、3、4、5。一旦细胞分化成神经元，它们就不能增殖或增加其数量，因此，在后期阶段维持NPC是很重要的。通过细胞-细胞相互作用的槽口信令在维持NPC6，7中起着重要的作用。凹槽配体与邻近细胞表面的膜蛋白Notch相互作用，并激活Notch蛋白。激活后，诺奇蛋白发生蛋白解解，从而将Notch（NICD）的细胞内域从细胞膜释放到细胞核8、9、10中。在核中，NICD与Hes1和Hes5（Hes1/5）的启动子区域结合，并激活这些基因的表达。 Hes1/5抑制前神经基因Ascl1和Neurogenin1/2（Neurog1/2）的表达11，12，13，14。由于前神经基因诱导神经元分化，Hes1/5在维持NPC中起着至关重要的作用。此外，由于前神经基因可以激活诺奇配体三角洲（Dll1）的表达，Hes1/5还抑制Dll1的表达。因此，Dll1的表达导致通过Notch信令对Dll1的相邻细胞呈阴性。这样，细胞会抑制相邻细胞遵循其相同的命运，这种现象称为横向抑制8。在发育中的大脑中，横向抑制在产生各种不同的细胞类型方面起着作用。
在单个单元水平上的实时成像揭示了NPC15、16、17中Notch信号分量的动态表达。Notch信号激活Hes1的表达，但Hes1蛋白与它自己的启动子结合并抑制它自己的表达。此外，Hes1是一种极不稳定的蛋白质，由泛基蛋白-蛋白酶体通路降解;因此，对自身促进者的压制只是短暂的，然后转录又开始了。这样，Hes1的表达在2小时周期18的转录和平移水平上振荡。Hes1的振荡表达，反过来，通过周期性抑制15，16，17，19，诱导下游目标基因的振荡表达，如Ascl1，Neurog2和Dll1。 虽然前神经基因可以诱导神经元分化，但振荡表达不足以进行神经元分化;而是它们的持续表达对神经元分化至关重要。前神经基因的振荡表达对于维持NPC很重要，而不是诱导神经元分化14，15，16。Dll1的表达在各种形态形成（如神经发生和躯体发生）期间在转录和转化水平上振荡。Dll1的动态表达对Dll1的正常形态发生和稳定表达具有重要的诱导神经发生缺陷和躯体发生缺陷17。这些发现证明了基因表达和蛋白质动力学对调节各种发育事件（即不同的表达动力学在细胞行为中产生不同输出）的重要作用。
为了分析Notch信号的动态，组织和细胞的静态分析是不够的，因为它们在不断变化。单细胞的实时成像是揭示基因表达动态的有力工具。Notch信号分子的动态表达在2-3小时周期内发生快速循环反应。这种快速的周期性表达为实时监测带来了两个难题：（1）分子的表达被抑制到低水平，（2）快速周转需要快速响应的记者从。为了克服这些问题，我们之前开发了一种生物发光实时成像方法20。由于生物发光报告仪比荧光报仪具有更高的灵敏度和较短的成熟时间，因此这种策略使我们能够监测活细胞的快速动力学。使用实时可视化，我们发现更多的基因表现出动态表达比我们之前认为的。此外，显示活细胞表达和蛋白质动力学的报告数量以及这些动力学在各种生物事件中的重要性有所增加，这表明动力学在基因表达中的基本作用21，22。
在本报告中，我们描述了一种在分离区域性和皮质切片培养中可视化 NPC 中 Notch 配体 Dll1 表达式的方法。为了监测单细胞水平Dll1转录的动态，我们产生了从携带pDll1-Ub-Fluc报告器的转基因小鼠的胚胎端管中衍生的NPC分离培养物，该实验鼠是Dll1启动子驱动的不稳定的荧光酶报告者。为了监测体内的Dll1蛋白动力学，我们将Dll1-Fluc融合报告器引入皮层中的NPC，并可视化了报告器在皮质切片培养中的NPC的表达。实时成像使我们能够以高时间分辨率捕捉活细胞中基因表达和蛋白质动力学的各种特征。
Protocol
Representative Results
Discussion
Notch信号的分量在发生过程中显示振荡表达同步，但在神经发生期间不同步，导致在后一种情况下通过静态分析捕获表达动力学的困难。因此，需要实时监控来揭示 Notch 信令分量（如Hes1和Dll1）的表达动态。由于Hes1和Dll1振荡的表达周期极短，因此需要大约 2-3 小时、快速响应和不稳定的报告器来监测其表达动态。为此，我们开发了生物发光报告仪和成像系统。生物发光?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢岩本裕子支持制作该视频。我们也感谢伊索拉伊郎对图像分析的讨论和支持，宫崎骏为转基因动物的生成提供技术支持，Yuji Shinjo（奥林匹斯医学科学），江川正雄（奥林匹斯医学科学），石津（石津）奥林巴斯医学）和吴昆田基（日本安多）为生物发光成像系统的技术支持和讨论。这项工作得到了进化科学和技术核心研究（JPMJCR12W2）（R.K.）、创新领域科学研究资助（H.S.MEXT 24116705和R.K.MEXT 16H06480）的支持，科学研究资助（C）的支持。18K06254（H.S.），日本文部科学省，以及日本教育、文化、体育、科学和技术部的动态生活系统方法平台。
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
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