Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine
Summary
Le cellule staminali neurali/progenitrici mostrano varie dinamiche di espressione dei componenti di segnalazione di Notch che portano a diversi risultati di eventi cellulari. Tale espressione dinamica può essere rivelata dal monitoraggio in tempo reale, non dall’analisi statica, utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile che consente la visualizzazione di rapidi cambiamenti nelle espressioni geniche.
Abstract
La segnalazione di notch regola il mantenimento delle cellule staminali/progenitrici neurali mediante interazioni cellula-cellula. I componenti della segnalazione Notch presentano un’espressione dinamica. L’efere di segnalazione della nota Hes1 e il Delta-simile a 1 (Dll1) del ligando di Notch sono espressi in modo oscillatorio nelle cellule staminali/progenitrici neurali. Poiché il periodo dell’espressione oscillatoria di questi geni è molto breve (2 h), è difficile monitorarne l’espressione ciclica. Per esaminare tali rapidi cambiamenti nell’espressione genica o nella dinamica delle proteine, sono necessari giornalisti a risposta rapida. A causa della sua cinetica a maturazione rapida e dell’elevata sensibilità, il reporter di bioluminescenza luciferasi è adatto per monitorare i rapidi cambiamenti dell’espressione genica nelle cellule viventi. Abbiamo usato un giornalista di luciferasi destabilizzato per monitorare l’attività promotore e un reporter con luciferasi fuso per la visualizzazione delle dinamiche proteiche a risoluzione cellulare singola. Questi reporter di bioluminescenza mostrano un rapido turnover e generano segnali molto deboli; pertanto, abbiamo sviluppato un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile per rilevare tali deboli segnali. Questi metodi ci permettono di monitorare varie dinamiche di espressione genica nelle cellule viventi e nei tessuti, che sono informazioni importanti per aiutare a comprendere gli stati cellulari effettivi.
Introduction
Il cervello dei mammiferi è composto da un gran numero di vari tipi di neuroni e cellule gliali. Tutte le cellule sono generate da cellule staminali neurali,progenitrici (NPC), che prima proliferano per espandere il loro numero, poi iniziano a differenziarsi in neuroni, e infine danno origine a cellule gliali1,2,3,4,5. Una volta che le cellule si sono differenziate in neuroni, non possono proliferare o aumentare il loro numero e, quindi, il mantenimento dei PNG fino a quando le fasi successive non sono importanti. La segnalazione della notch tramite interazioni cella-cellula svolge un ruolo importante nel mantenimento dei PNG6,7. I ligandi Notch interagiscono con la proteina della membrana, Notch, sulla superficie delle cellule vicine e attivano la proteina Notch. Dopo l’attivazione, si verifica la proteolisi della proteina Notch, rilasciando così il dominio intracellulare di Notch (NICD) dalla membrana cellulare nel nucleo8,9,10. Nel nucleo, NICD si lega alle regioni promotrice di Hes1 e Hes5 (Hes1/5) e attiva l’espressione di questi geni. Hes1/5 reprime reprime reprimere l’espressione dei geni proneurali Ascl1 e Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Poiché i geni proneurali inducono la differenziazione neuronale, Hes1/5 svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dei PNG. Inoltre, poiché i geni proneurali possono attivare l’espressione del Delta-come1 (Dll1), Hes1/5 reprimere anche l’espressione di Dll1. Pertanto, l’espressione di Dll1 porta alle celle adiacenti essere negativo per Dll1 tramite segnalazione Notch. In questo modo, le cellule impediscono alle cellule adiacenti di seguire il loro stesso destino, un fenomeno noto come inibizione laterale8. Nel cervello in via di sviluppo, l’inibizione laterale svolge un ruolo nella generazione di vari tipi di cellule diverse.
L’imaging in tempo reale a livello di singola cellula rivela le espressioni dinamiche dei componenti della segnalazione di Notch nei PNG15,16,17. La segnalazione di notch attiva l’espressione di Hes1, ma la proteina Hes1 si lega al proprio promotore e reprime la propria espressione. Inoltre, Hes1 è una proteina estremamente instabile, che è degradata dal percorso onniquitina-proteasome; pertanto, la repressione del proprio promotore è solo di breve durata e poi la trascrizione ricomincia. In questo modo, l’espressione di Hes1 oscilla sia a livello di trascrizione che a livello traslazionale in un ciclo di 2 h18. L’espressione oscillatoria di Hes1, a sua volta, induce l’espressione oscillatoria dei geni bersaglio a valle, come Ascl1, Neurog2 e Dll1, attraverso la repressione periodica15,16,17,19. Mentre i geni proneurali possono indurre la differenziazione neuronale, la loro espressione oscillatoria non è sufficiente per la differenziazione neuronale; piuttosto la loro espressione sostenuta è essenziale per la differenziazione neuronale. L’espressione oscillatoria dei geni proneurali è importante per mantenere i PNG piuttosto che per indurre la differenziazione neuronale14,15,16. L’espressione di Dll1 oscilla sia a livello di trascrizione che a livello traslazionale durante varie morfogenesi, come la neurogenesi e la somitogenesi. L’espressione dinamica di Dll1 è importante per la normale morfogenesi e l’espressione costante di Dll1 induce difetti nella neurogenesi e somitogenesi17. Questi risultati dimostrano l’importante funzione che la dinamica dell’espressione genica e della cinetica proteica ha sulla regolazione di vari eventi dello sviluppo (cioè, dinamiche di espressione diverse producono risultati diversi nei comportamenti cellulari).
Per analizzare la dinamica della segnalazione di Notch, l’analisi statica dei tessuti e delle cellule è insufficiente perché cambia in continua evoluzione. L’imaging in tempo reale di singole cellule è un potente strumento per rivelare le dinamiche nell’espressione genica. L’espressione dinamica delle molecole di segnalazione Notch subisce risposte cicliche rapide nel periodo di 2-3 h. Questa rapida espressione periodica presenta due problemi difficili per il monitoraggio in tempo reale: (1) l’espressione delle molecole viene soppressa a bassi livelli e (2) un rapido turnover richiede una risposta rapida ai giornalisti. Per superare questi problemi, abbiamo precedentemente sviluppato un metodo di imaging in tempo reale di bioluminescenza20. Poiché il reporter di bioluminescenza ha una sensibilità più elevata e tempi di maturazione più brevi rispetto ai reporter fluorescenti, questa strategia ci permette di monitorare le dinamiche rapide nelle cellule viventi. Utilizzando la visualizzazione in tempo reale, abbiamo scoperto che più geni mostravano un’espressione dinamica di quanto pensassimo in precedenza. Inoltre, è aumentato il numero di rapporti che mostrano l’espressione e la dinamica delle proteine nelle cellule viventi e il significato di queste dinamiche in vari eventi biologici, suggerendo un ruolo fondamentale delle dinamiche nelle espressioni geniche21,22.
In questo rapporto viene descritto un modo per visualizzare l’espressione della Dll1 del ligando di Notch nei PNG sia nelle colture dissociate che nelle colture di taglio corticali. Per monitorare la dinamica della trascrizione Dll1 a livello di singola cellula, abbiamo generato colture dissociate di PNG derivate dal telencefano embrionale di topi transgenici che trasportano pDll1-Ub-Fluc reporter, un giornalista di luciferasi destabilizzate destabilizzato guidato dal promotore di Dll1. Per monitorare le dinamiche delle proteine Dll1 in vivo, abbiamo introdotto il reporter di fusione Dll1-Fluc nei PNG nella corteccia e abbiamo visualizzato l’espressione del reporter nei PNG nelle colture di fette corticali. L’imaging in tempo reale ci ha permesso di catturare le varie caratteristiche dell’espressione genica e della dinamica delle proteine nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale.
Protocol
Representative Results
Discussion
I componenti della segnalazione di Notch mostrano espressioni oscillatorie in sincronia durante la somitogenesi ma fuori sincronia durante la neurogenesi, portando alle difficoltà nel catturare la dinamica dell’espressione mediante analisi statica in quest’ultimo caso. Pertanto, il monitoraggio in tempo reale è necessario per rivelare la dinamica di espressione dei componenti di segnalazione Notch, ad esempio Hes1 e Dll1. Poiché i periodi delle espressioni delle oscillazioni Hes1 e Dll1<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Yumiko Iwamoto per aver sostenuto la produzione del video. Siamo anche grati ad Akihiro Isomura per la discussione e il supporto dell’analisi delle immagini, Hitoshi Miyachi per il supporto tecnico per la generazione di animali transgenici, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) e Ouin Kunitaki (Andor Japan) per il supporto tecnico e le discussioni del sistema di imaging di bioluminescenza. Questo lavoro è stato supportato da Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. and MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (CPS) (JSPS) 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. e H.S.) e Piattaforma per gli approcci dinamici al sistema vivente del Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia, Giappone.
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
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