यह प्रोटोकॉल रोगी बायोप्सी में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का निष्पक्ष पता लगाने के लिए है 16S rRNA द्वारा situ संकरीकरण और confocal माइक्रोस्कोपी में.
मेजबान म्यूकोसल सतहों और ऊतकों के साथ बैक्टीरिया की बातचीत का दृश्य रोगजनन के तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। जबकि संक्रमण के पशु मॉडल में जीवाणु रोगजनकों के दृश्य ऐसे GFP के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर जीवाणु उपभेदों पर भरोसा कर सकते हैं, बायोप्सी या मानव रोगियों से प्राप्त ऊतक के mucosa के भीतर बैक्टीरिया के दृश्य की आवश्यकता है एक निष्पक्ष विधि। यहाँ, हम मानव बायोप्सी वर्गों में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन. इस विधि में एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ situ संकरीकरण (फिश) में फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल 16S rRNA के लिए सार्वभौमिक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच के लिए मूत्राशय बायोप्सी वर्गों आवर्तक से पीड़ित रोगियों से प्राप्त के भीतर ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया लेबल करने के लिए मूत्र पथ संक्रमण। एक सार्वभौमिक 16S RRNA जांच के उपयोग के माध्यम से, बैक्टीरिया प्रजातियों के पूर्व ज्ञान के बिना पता लगाया जा सकता है, वंश, या जैव रासायनिक विशेषताओं, जैसे lipopolysaccharide (LPS), कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक होगा. हम confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए बायोप्सी निर्धारण से 16S rRNA FISH के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल ऊतक के लगभग किसी भी प्रकार में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और रोगी के ऊतकों में चिकित्सकीय प्रासंगिक जीवाणु-होस्ट बातचीत के निष्पक्ष दृश्य के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है. इसके अलावा, प्रजातियों या वंश-विशिष्ट जांचों का उपयोग करके, इस प्रोटोकॉल को रोगी के ऊतकों के भीतर विशिष्ट जीवाणु रोगजनकों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
मूत्रमार्ग, मूत्राशय, मूत्रवाहिनी और गुर्दे से मिलकर मूत्र पथ लगातार बैक्टीरिया है कि मूत्र microbiome शामिल करने के साथ ही यूरोपैथोजनक ई. कोलाई (UPEC) की तरह, यूरोपैथोजेनिक ई. कोलाई (UPEC) की तरह, के संपर्क में लगातार है 1,2. हाइड्रेटेड श्लेष्म की एक परत जिसमें ग्लाइकोसामिनोग्लीकन्स और ग्लाइकोसिलेटेड यूरोप्लाकिन प्रोटीन का एक अपारगम्य पट्टिका होती है जो सतही कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की जाती है, एक अवरोध बनाती है जो नियमित रूप से मूत्राशय उपकला को अनुलग्न द्वारा आक्रमण से बचाती है। बैक्टीरिया3,4. मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) के दौरान, इन बाधाओं को परेशान या नष्ट कर रहे हैं, uropathogenic बैक्टीरिया5,6द्वारा मूत्राशय उपकला के लगाव और आक्रमण की सुविधा. Murine मॉडल में काम से पता चला है कि कई uropathogenic बैक्टीरिया सहित UPEC, Klebsiella निमोनिया, और Enterococcus faecalis सतही कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के भीतर प्रतिकृति intracellular समुदायों (आईबीसी) फार्म कर सकते हैं और संक्रमणकालीन उपकला कोशिकाओं के भीतर शांत इंट्रासेल्यूलर जलाशय (क्यूआईआर)7,8,9. यद्यपि यू पी पी सी की पहचान मानव यूटीआई रोगियों से शेड उपकला कोशिकाओं के भीतर की गई है , फिर भी मानव में मूत्राशय के श्लेष्म के साथ यूरोपैथोजेन्स की बातचीत को पहले से10कल्पना नहीं की गई थी .
हमने उन्नत के लिए ट्राइगोनिटिस (सीईएफटी) के इलेक्ट्रोफुलगुरेशन के साथ सिस्टोस्कोपी से गुजर ने पोस्टमेनोपॉज़ल रोगियों से प्राप्त मूत्राशय बायोप्सी के श्लेष्म के भीतर बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक आम तकनीक, सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) में फ्लोरोसेंट अनुकूलित किया। एंटीबायोटिक-रिफ्रैक्टरी आवर्ती यूटीआई11का प्रबंधन | 16S rRNA के लिए एक सार्वभौमिक जांच का उपयोग करना, हम निष्पक्ष आवर्ती यूटीआई रोगियों के मूत्राशय mucosa के साथ जुड़े जीवाणु प्रजातियों का पता लगाने और मूत्राशय की दीवार12के भीतर उनकी स्थिति का निर्धारण करने में सक्षम थे. सार्वभौमिक 16S RRNA न्यूक्लिओटाइड जांच पहले जीवाणु 16S rRNA13के एक संरक्षित क्षेत्र को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया गया था, जो ई. कोलाई 16s RRNA के 388-355 पदों से मेल खाती है. 16S RRNA और हाथापाई जांच दृश्यों पहले मान्य किया गया है और माउस जठरांत्र संबंधी मार्ग14,15में उपयोग के लिए प्रकाशित . जाँचों के अनुक्रमों और गुणों का वर्णन सारणी 1में किया गया है। यह इस प्रोटोकॉल में दो अनुक्रमिक वर्गों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, एक 16S rRNA जांच के लिए और एक हाथापाई जांच के लिए, मूत्राशय उपकला के रूप में सच और पृष्ठभूमि संकेत के बीच भेद करने में सक्षम होने के लिए, कोलेजन और elastin प्रदर्शन autofluorscence16 . इस प्रोटोकॉल में, 16S rRNA और हाथापाई जांच फ्लोरोसेंट एलेक्सा फ्लोर 488 लेबल के साथ डिजाइन किए गए थे दोनों पर 3′ और 5′ टर्मिनी के माध्यम से एन-hydroxysuccinimide (एनएचएस) एस्टर लिंकेज फ्लोरोसेंट संकेत बढ़ाने के लिए.
हालांकि इस प्रोटोकॉल मानव मूत्राशय बायोप्सी वर्गों पर उपयोग के लिए विकसित किया गया था, यह आसानी से किसी भी ऊतक जहां बैक्टीरिया रहते हैं माना जाता है से पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों के विपरीत जो जीवाणु सतह पर विशिष्ट एंटीजन (उदा., lipopolissaccharide) को लक्षित करते हैं, इस विधि के लिए ऊतक-संबद्ध बैक्टीरिया द्वारा व्यक्त एंटीजन के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहींहै 10,17 . सार्वभौमिक 16S RRNA जांच का उपयोग नमूने के भीतर सभी जीवाणु प्रजातियों के निष्पक्ष पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन उनकी पहचान के निर्धारण की अनुमति नहीं है. पता लगाया बैक्टीरिया की पहचान निर्धारित करने के लिए, प्रजातियों या जीनस-विशिष्ट 16S या 23S RNA जांच का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह प्रोटोकॉल मेजबान ऊतक से जुड़े फंगल रोगजनकों, जैसे कैंडिडा एल्बिकन्सका भी पता नहीं लगाएगा। कवक रोगजनकों का पता लगाने के लिए, 28S या 18S RRNA जांच18इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
यहाँ, हम मानव मूत्राशय बायोप्सी में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन द्वारा 16S rRNA FlSH. इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य ऊतकों से ली गई बायोप्सी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे जठरांत्र संबंधी मार्ग या त्वचा, और स्तनधारी मॉडल जीवों की एक किस्म से काटा ऊतकों के लिए बढ़ाया जा सकता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल भी कई निर्धारण के उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, formalin, इथेनॉल, methacarn) और ऊतक तैयारी तकनीक (उदाहरण के लिए, पैराफिन या राल एम्बेडेड, और cryopreserved ऊतकों). डबल लेबल सार्वभौमिक 16S RRNA जांच ऊतक के भीतर मौजूद सभी जीवाणु प्रजातियों के निष्पक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है और कैसे रोगजनकों और microbiota स्थानिक रूप से रोग और स्वस्थ में mucosal सतहों के साथ बातचीत में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं राज्यों. इस तरह के probeBase, PhylOPDb या प्रजातियों या वंश-विशिष्ट 16S या 23S RNA जांच के चयन या डिजाइन के लिए ARB सॉफ्टवेयर पैकेज के प्रोब जेड डिजाइन उपकरण के रूप में संसाधनों का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों या वंश का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ऊतक15,21,22के भीतर . इस विधि के लिए एक महत्वपूर्ण भविष्य की दिशा प्रजातियों का उपयोग कर multiplexing है- या वंश-विशिष्ट जांच मूत्राशय श्लेष्म के भीतर माइक्रोबियल विविधता के मूल्यांकन के लिए अलग, असतत फ्लोरोफोर के साथ लेबल.
मानव नमूनों पर उपयोग के लिए इस विधि की प्राथमिक सीमा बायोप्सी ऊतक की उपलब्धता है। संस्थागत समीक्षा बोर्ड अनुमोदन और सूचित रोगी सहमति बायोप्सी प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं और प्रक्रिया प्रदर्शन चिकित्सक के साथ प्रत्यक्ष सहयोग इष्टतम नमूना संग्रह और रोगी मेटाडेटा के लिए उपयोग के लिए आवश्यक है. CEFT प्रक्रिया ही मूत्राशय उपकला को नष्ट कर देता है तो हम प्रक्रिया से पहले इन क्षेत्रों की बायोप्सी का औचित्य साबित करने में सक्षम थे. एक धूआं हुड या उचित रूप से फिट जैव सुरक्षा कैबिनेट deparaffinization कदम में विषाक्त xylenes के उपयोग और प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ वातावरण बनाए रखने की जरूरत के कारण इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, अधिमानतः confocal, एक 63x या एक 100x उद्देश्य और Hoechst, Alexa-555, और Alexa-488 के दृश्य के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है. चित्र 1 में चित्रित प्रतिनिधि परिणामों को लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इसी तरह लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप तुलनीय छवियों का उत्पादन करना चाहिए. इस प्रोटोकॉल केवल ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने की क्षमता द्वारा सीमित है और नहीं, उदाहरण के लिए, कवक. जांच विशिष्ट कवक 18S या 28S rRNA ऊतक18के भीतर कवक रोगजनकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए .
इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ वातावरण को बनाए रखने और यह सुनिश्चित करना है कि ऊतक संकरीकरण और धुंधला कदम के बीच बाहर सूखी नहीं है शामिल हैं. यदि प्रक्रिया के दौरान ऊतक सूख जाता है, तो सिग्नल कम हो सकता है या ऊतक धोने के चरण के दौरान स्लाइड से गिर सकता है। यह भी हमेशा इस प्रोटोकॉल के लिए दो सीरियल वर्गों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है – एक 16S rRNA जांच के लिए और एक हाथापाई जांच के लिए. इस नियंत्रण के बिना, यह झूठी सकारात्मक भेद करने के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है और प्राप्त डेटा उपयोगी या जानकारीपूर्ण नहीं हो सकता है. यदि इस प्रोटोकॉल सार्वभौमिक 16S rRNA जांच के अलावा अन्य एक जांच के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा रहा है, देखभाल एक उपयुक्त संकरीकरण तापमान का चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए, लगभग 5 डिग्री सेल्सियस जांच की भविष्यवाणी पिघलने के तापमान से कम. संकेत तीव्रता बनाए रखने के लिए, जांच के बाद लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क में नहीं होना चाहिए और माइक्रोस्कोपी के दौरान ओवरexposed नहीं होना चाहिए। अंत में, माइक्रोस्कोपी के दौरान FLUOROFसे के लिए इसी चैनल के लिए एक ही सेटिंग्स FISH जांच करने के लिए संगत प्रयोगात्मक (16S rRNA जांच) और नियंत्रण (स्क्रैम्बल जांच) स्लाइड के बीच संगत रखा जाना चाहिए. रोगी व्युत्पन्न ऊतकों के mucosal सतहों के भीतर बैक्टीरिया के स्थानिक संबंध कल्पना को समझने और मेजबान-रोगजनक बातचीत अंतर्निहित संक्रामक रोग के बारे में नैदानिक रूप से प्रासंगिक hypotheses के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रोटोकॉल सलाह और तकनीकी सहायता के लिए अमांडा Arute के लिए किम ओर्थ और Marcela डे सूजा सैंटोस शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. यह काम आंशिक रूप से के.पी. द्वारा आयोजित सिस्टम जीव विज्ञान में सेसिल एच और Ida ग्रीन चेयर द्वारा समर्थित किया गया था.
Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
0.22 micron syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |