باستخدام Tg (Vtg1:mcherry) أجنة حمار وحشي لاختبار الآثار الإستروجين من المركبات تعطيل الغدد الصماء
Summary
هنا هو بروتوكول مفصل لاستخدام أجنة حمار وحشي Tg (vtg1: mCherry) للكشف عن الآثار الإستروجين. ويغطي البروتوكول انتشار الأسماك وعلاج الأجنة، ويؤكد على الكشف عن الإشارات الفلورية المستحثة عن طريق مركبات اختلال الغدد الصماء وتوثيقها وتقييمها.
Abstract
هناك العديد من المركبات المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDC) في البيئة ، وخاصة المواد الإستروجين. ومن الصعب اكتشاف هذه المواد بسبب تنوعها الكيميائي؛ ولذلك، تستخدم أساليب اكتشاف التأثيرات بشكل متزايد، مثل الكائنات الحية الحساسة للتأثيرات/الكائنات الحية المسببة للاستروجين. وتشمل هذه الكائنات الحية التي تقوم بصيد الأسماك عدة نماذج من الأسماك. يغطي هذا البروتوكول استخدام خط الحمار الوحشي Tg(vtg1: mCherry) المحور وراثياً ككائن حيوي، بما في ذلك انتشار الأسماك ومعالجة الأجنة، مع التركيز على الكشف عن الإشارات الفلورية التي تسببها EDC وتوثيقها وتقييمها. والهدف من العمل هو عرض لاستخدام Tg (vtg1: mCherry) الأجنة خط المعدلة وراثيا للكشف عن الآثار الإستروجين. يوثق هذا العمل استخدام أجنة حمار وحشي معدلة وراثيا Tg(vtg1: mCherry) للكشف عن آثار إستروجين عن طريق اختبار اثنين من المواد الاستروجينية، α- و β زيارالينول. البروتوكول الموصوف هو فقط أساس لتصميم عمليات الفحص؛ يمكن أن تختلف طريقة الاختبار وفقا لنقاط نهاية الاختبار والعينات. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين ذلك مع أساليب أخرى للتشايس، وبالتالي تسهيل استخدام خط المعدل وراثيا في المستقبل.
Introduction
هناك عدد كبير من المركبات المعطلة للغدد الصماء (EDC) التي هي من بين المواد الأكثر خطورة في بيئتنا. هذه هي أساسا مركبات إستروجين التي تلوث المياه من الموارد الطبيعية. إن التنوع الكيميائي للمواد التي تنتمي إلى المجموعة يجعل من الصعب إجراء الاختبارات اللازمة لوجودها، حيث أن هناك حاجة إلى طرق تحليلية مختلفة للكشف عنها. استناداً إلى التركيب الكيميائي من الصعب جداً تحديد ما إذا كانت مادة ما قادرة فعلاً على العمل كهرمون الاستروجين. بالإضافة إلى ذلك ، هذه المواد لا تكون موجودة أبدا في شكل نقي في البيئة ، لذلك قد تتأثر آثارها بالمركبات الأخرى ، أيضا1. ويمكن حل هذه المشكلة عن طريق أساليب الكشف عن الأثر، مثل استخدام الكائنات الحية مراقب الحيوي / bioindicator التي تظهر آثاراستروجين 2،3،4،5.
في الآونة الأخيرة، مجموعة متنوعة من خط الخلية6 والخميرة القائمة على أنظمة الاختبار2،,وقد تم تطوير3 للكشف عن الآثار إستروجين. ومع ذلك، هذه عموما قادرة فقط على الكشف عن ربط المادة لمستقبلات هرمون الاستروجين2،3. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها غير قادرة على نموذج العمليات الفسيولوجية المعقدة في الكائن الحي، أو للكشف عن مراحل حساسة للهرمونات من مراحل الحياة؛ وبالتالي، فإنها تؤدي في كثير من الأحيان إلى نتائج خاطئة.
ومن المعروف أن بعض الجينات تتفاعل بحساسية للاستروجين في الكائنات الحية7. الكشف عن المنتجات الجينية عن طريق طرق البيولوجيا الجزيئية هو أيضا ممكن على مستوى البروتين أو مرنا8،9، ولكن عادة ما ينطوي على التضحية الحيوانية. قوانين حماية الحيوان أصبحت أكثر صرامة، وهناك طلب متزايد على أنظمة اختبار بديلة تقلل من عدد ومعاناة الحيوانات المستخدمة في التجارب أو استبدال نموذج الحيوان بنظام نموذجي آخر10. مع اكتشاف البروتينات الفلورسنت وإنشاء خطوط المؤشرات الحيوية، والتكنولوجيات المعدلة وراثيا توفير بديل جيد11. مع هذه الخطوط، يمكن اختبار تنشيط جين حساس للاستروجين في الجسم الحي.
ومن بين الفقاريات، لا تزال إمكانات الأسماك في تقييم المخاطر البيئية غير مُجدّة. وهي توفر العديد من المزايا على نماذج الثدييات: كونها كائنات مائية ، فهي قادرة على امتصاص الملوثات من خلال كامل جسمها ، وإنتاج عدد كبير من النسل ، وتتميز بعض أنواعها بوقت جيل قصير. نظام الغدد الصماء والعمليات الفسيولوجية تظهر أوجه تشابه كبيرة مع الفقاريات الأخرى وحتى مع الثدييات، بما في ذلك البشر12.
ومن المعروف أيضا العديد من الجينات للكشف عن الآثار الإستروجين في الأسماك. أهمها هي مستقبلات هرمون الاستروجين aromatase-B, choriogenin-H, و vitellogenin (vtg)7,13. مؤخرا، كما تم إنشاء العديد من خطوط هرمون الاستروجين المنتجة للحساسية البيولوجية من نماذج الأسماك المستخدمة في المختبر، مثل من حمار وحشي (Danio rerio)4،5،14،15،16،17.5 والميزة الرئيسية للحمار الوحشي في خلق خطوط biosensor هو هيئة شفافة من الأجنة واليرقات، لأن إشارة مراسل الفلورسنت يمكن بعد ذلك أن تدرس بسهولة في الجسم الحي دون التضحية الحيوان10. بالإضافة إلى حماية الحيوان، بل هو أيضا ميزة قيمة لأنها تسمح لدراسة رد فعل نفس الفرد في أوقات مختلفة من العلاج18.
هذه التجارب استخدام vitellogenin مراسل محورة وراثيا خط حمار وحشي15. بناء transgene المستخدمة في تطوير Tg (vtg1:mCherry) لديه طويلة (3.4 كيلو بايت) الطبيعية vitellogenin-1 المروج. مستقبلات الإستروجين (ER) هو بروتين محسن تنشيطها ligands الذي هو ممثل من الستيرويد / مستقبلات نووية superfamily. ER يربط إلى تسلسلات الحمض النووي محددة تسمى عناصر استجابة الإستروجين (EREs) مع تقارب عالية وtransactivates التعبير الجيني استجابة لاستراديول وغيرها من المواد الاستروجينية، لذلك فإن أكثر ERE في المروج يسبب استجابة أقوى19. هناك 17 مواقع ERE في المنطقة المروج من Tg (vtg1:mCherry) بناء transgene ومن المتوقع أن تحاكي التعبير عن الجين vtg الأصلي15. هناك تعبير مستمر عن إشارة الفلورسنت في الإناث نضجت جنسيا. ومع ذلك، في الذكور والجنين التعبير في الكبد هو فقط مرئية على العلاج مع المواد إستروجين (الشكل 1).
الشكل 1: إشارة فلورية حمراء في الكبد من vtg1:mCherry الحمار الوحشي الكبار المعدلة وراثيا و 5 أجنة dpf، بعد 17-ß-استراديول (E2) التعريفي. في الإناث والذكور في تعامل مع E2 (25 ميكروغرام / لتر وقت التعرض: 48hrs) الفلوري قوية من الكبد مرئية حتى من خلال الجلد المصطبغ. لا توجد إشارة فلورية مرئية في الذكور غير المعالجين (A). بعد E2 التعريفي (50 ميكروغرام / لتر وقت التعرض: 0-120 حصانا)، إشارة الفلورسنت الحمراء في الكبد من 5 أجنة dpf يمكن أيضا أن يلاحظ، والتي ليست مرئية في الأجنة التحكم (B). في حين أن إشارة الفلورسنت موجودة باستمرار في الإناث البالغات ، فإن الذكور وأجنة الخط مناسبة للكشف عن آثار الإستروجين. (BF: حقل مشرق، mCherry: عرض مرشح الفلورسنت الأحمر، صور عادية واحدة، شريط مقياس A: 5mm، شريط مقياس B: 250 ميكرومتر) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على غرار الـ”فيتيلوجينين” الداخلي، يتم التعبير عن مراسل mCherry فقط في الكبد. لأن يتم إنتاج فيتيلوجينين فقط في وجود هرمون الاستروجين، لا توجد إشارة الفلورسنت في الضوابط. لأن التعبير هو فقط في الكبد، وتقييم النتائج هو أسهل بكثير15.
وقد تم التحقيق حساسية وسهولة الاستخدام من أجنة هذا الخط على مختلف خليط مركب استروجين وأيضا على العينات البيئية15,20, وفي معظم الحالات تم توثيق العلاقة الجرعة والاستجابة ( الشكل2). ومع ذلك، في حالة المواد السمية للغاية، السمية الكبدية أساسا (مثل zearalenone)، فقط إشارة الفلورسنت ضعيفة جدا قد تكون مرئية في كبد الأجنة المعالجة ويمكن الوصول إلى إشارة الفلورسنت كثافة قصوى تسبب ضمن نطاق تركيز صغير جدا، مما يجعل من الصعب إقامة علاقة الجرعة تأثير20.
الشكل 2: الرسم التخطيطي للجرعات والاستجابة (A) والصور الفلورية (mCherry) للكبد (B) المعرضة لـ 17-α-ethynilestradiol (EE2)، في 5 dpf vtg1:mCherry اليرقات. ويعبر عن النتائج على أنها كثافة متكاملة تولد من قوة الإشارة وحجم المنطقة المتأثرة (±SEM، n = 60). 100% يشير إلى الحد الأقصى الملاحظ. زادت كثافة الإشارة الفلورسنت تدريجيا مع التركيز. شريط مقياس = 250 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هناك العديد من المواد الإستروجين موجودة في البيئة، مثل 17-β-استراديول (التركيز البيئي: 0.1-5.1 نانوغرام/لتر)21، 17-α-ethynylestradiol (التركيز البيئي: 0.16-0.2 ميكروغرام/لتر22, zearalenone (التركيز البيئي: 0.095-0.22 ميكروغرام /لتر)23, بيسفينول-A (التركيز البيئي: 0.45-17.2 ملغم/لتر)24. عند اختبار هذه المواد في شكل نشط نقي بمساعدة الأجنة المتحولة وراثيا mCherry، كانت أقل تركيزات تأثير ملحوظ (LOEC) للكشف عن علامة الفلورسنت 100 نانوغرام / لتر ل17-ß-استراديول، 1 نانوغرام/لتر ل17-α-ethynilestradiol, 100 ng/L للزيارالينون, و 1 ملغ/لتر للبيسفينول-A (96-120 حصانا) علاج, وهو قريب جدا أو ضمن نطاق تركيزات بيئية للمواد15. يمكن أن يساعد خط Tg(vtg1:mCherry) المعدل وراثياً في اكتشاف إستروجين في عينات مياه الصرف الصحي بعد التعرض المباشر. خط حساس مثل اختبار الاستروجين الخميرة المستخدمة عادة، و bioluminiscent الخميرة الاستروجين (BLYES) مقايسة15. بمساعدة هذا الخط، تم تأكيد الآثار الوقائية من بيتا-cyclodextrins ضد السمية الناجمة عن الزيارالينون باستخدام الخلائط الكيميائية20.
في تقرير صدر مؤخرا، وقد ثبت في استخدام في الجسم الحي من خط المعدلة وراثيا مع مساعدة من اثنين من استروجين zearalenone (ZEA) الأيض، α- و β-zearalenol (α-ZOL و β-ZOL)25. خط الأساس البروتوكول مناسب لدراسة الآثار الإستروجين من عدة مركبات أو عينات بيئية على Tg (vtg1:mCherry) الأجنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد انتشر استخدام العوامل الحيوية/التحلل الحيوي لآثار الإستروجين في الدراسات السمية. في نماذج الجسم الحي تلعب دورا بارزا، لأنه على عكس الاختبارات في المختبر، فإنها لا توفر فقط معلومات حول استجابة خلية أو مستقبلات، ولكن أيضا السماح للتحقيق في العمليات المعقدة في الكائن الحي. وقد تم إنتاج …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المكتب الوطني للبحث والتطوير والابتكار التابع للصندوق الوطني للبحث والتطوير والابتكار؛ اتفاقية المنحة: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 مشروع مشترك من قبل الاتحاد الأوروبي، وبرنامج التميز المواضيعي NKFIH-831-10/2019 من جامعة Szent István، الذي منحته وزارة الابتكار والتكنولوجيا.
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen – a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments – A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins’ 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species – an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
