Her beskriver vi en robust metode til bestemmelse af immuncelleidentitet og renhed gennem epigenetiske signaturer opdaget ved hjælp af kvantitative PCR (qPCR). DNA-demethylering ved et bestemt locus fungerer som en entydig identifikator for en bestemt celletype og giver mulighed for identifikation af CD8+, regulatoriske eller Th17 T-celler.
Immuncelle subtype population frekvenser kan have en stor effekt på effekten af T celle behandlinger. Nuværende metoder, ligesom flow cytometri, har specifikke prøve krav, høj prøve input, er lav gennemløb, og er vanskelige at standardisere, som alle er skadelige for karakterisering af celleterapi produkter under deres udvikling og Fremstilling.
De analyser, der er beskrevet heri nøjagtigt identificere og kvantificere immuncelletyper i en heterogen blanding af celler ved hjælp af isoleret genomisk DNA (gDNA). DNA methylering mønstre afsløres gennem bisulfit konvertering, en proces, hvor umethylerede cytosiner omdannes til uracils. Umethylerede DNA-områder påvises ved qPCR forstærkning ved hjælp af primere rettet mod konverterede områder. Et entydigt locus pr. analyse måles og fungerer som en nøjagtig identifikator for en bestemt celletype. Analyserne er robuste og identificerer CD8+, regulatoriske og Th17 T-celler på en høj overførselsmåde. Disse optimerede analyser kan potentielt bruges til in-process og produkt frigivelse test for celleterapi proces.
Brugen af T-celler i cellulære immunterapi er steget betydeligt i løbet af det sidste årti, især med fremkomsten af kimære antigen receptor (CAR) T celle teknologi1. Mens T celle-baserede behandlinger er blevet mødt med stor klinisk succes, de er heterogene og celle egenskaber og identiteter kan variere betydeligt mellem donorer2. Heterogeniteten af T-cellepopulationer kan have stor indvirkning på terapeutisk effekt og komplicere konklusioner fra kliniske forsøg. Af denne grund er det afgørende at forstå T celle heterogenitet under produktfremstilling og formulering til at bestemme de optimale formuleringer af T celle immunterapier.
I bred forstand kan T-celler opdeles i to grupper: CD4+ hjælpestoffer T-celler, som udskiller immunmodulerende cytokiner, og CD8+ cytotoksiske T-celler, som direkte lyseceller præsenterer cognate-antigenet på store histokompatibilitetskompleks (MHC) I molekyler. CD4+ hjælpemiddel T-celler kan differentiere sig til et utal af specifikke undersæt, der producerer et unikt sæt cytokiner. Nogle foreslår, at et defineret forhold mellem CD4+ og CD8+ T-celler i slutcelleproduktet maksimerer in vivo-effekten og vedholdenhed, men kan komplicere cellefremstilling3. Regulatoriske T-celler (Tregs), en delmængde af CD4 + T celler, er immunsuppressive og mindske aktiveringen af immunceller. Regulatorisk T-celler har været involveret i mægle tumor tolerance og, hvis de findes under CAR T celle fremstilling, kan hæmme antitumor immunrespons af CAR T celler4,5,6. Andre CD4 + undersæt såsom T hjælper 17 (Th17) T-celler fremme tumor clearance og kan udnyttes til at øge effekten af T celle behandlinger. Således, stigende Th17 CD4 + T celler er af særlig interesse i solid tumor indstillinger, hvor øget produktion af interleukin 17 (IL-17) fremmer antitumor immunrespons5,7,8,9. Forståelse af betydningen af Th17 celler i tumor reaktioner har fået mere undersøgelse af strategier til at generere disse celler in vitro7,9. Derfor er metoder til påvisning af disse T-celleundersæt afgørende for optimering af T-cellebehandlinger og bør være robuste, nemme, skalerbare og reproducerbare.
Flow cytometri er den mest almindelige metode til at bestemme identiteten af en immuncelle. Men flow cytometri kræver levende, intakte celler, der skal analyseres på samme dag, de høstes. For intracellulær cytokin farvning (ICS), protein sekresekretorhæmning er nødvendig for at bevare cytokiner i T-celler. Men, forskellige inhibitor forbindelser har forskellige virkninger på udskillelsen af specifikke cytokiner, tvinger brugerne til at skabe specialiserede cocktails til påvisning af cytokin af interesse10,11. Derudover er troskaben af flow cytometri afhængig af antistof kloner, der binder specifikt og potent til deres mål. Brugen af forskellige antistofkloner kan forårsage varierende resultater og føre til upræcise konklusioner, hvilket gør metoden vanskelig at standardisere12. Endvidere kan analysen af data indsamlet via flowcytometri og dermed konklusioner fra dataene variere meget fra brugere baseret på, hvordan porte sættes13,14. Af disse grunde er flow cytometri ikke ideel til præcis kvalitetskontrol under celleterapi udvikling.
Vurderingen af genomisk methylering ved specifikke genloci er en alternativ metode til bestemmelse af celleidentitet. Begrundelsen for at anvende DNA-methylering til at identificere specifikke celletyper er beskrevet i flere artikler og bygger på specifikke methyleringsmønstre i en given cellepopulation15,16,17. I målceller indeholder visse steder umethylerede nukleotider, mens disse steder i celler, der ikke er målarter, er methyleret. Dette mønster kan påvises gennem bisulfit konvertering, en proces, der udelukkende konverterer umethyleret cytosin nukleotider (C) til uracil (U). Primere og sonder kan designes mod de ombyggede steder, derefter forstærkes og detekteres gennem qPCR16.
Analysen beskrevet heri måler hyppigheden af immuncelle undertyper i heterogene populationer ved at kvantificere antallet af specifikke umethylerede loci sammenlignet med et husholdning gen. Kopier af de umethylerede reguleringselementer for CD8 B-genet måles i CD8-analysen, FoxP3 i Treg og IL-17 i Th17 i denne analyse. Disse loci blev identificeret ved at isolere den specifikke cellepopulation af interesse (f.eks. cd8+ T-celler) og udføre bisulfitsekventering for at identificere loci, der kun er methyleret i den pågældende celletype15. Primere og sonder udvikles mod den entydigt umethylerede loci og prøver analyseres via qPCR. Der oprettes en standardkurve med kendte kopinumre fra fortyndinger af en høj kopinummersstandardplasmid, hvilket giver mulighed for konvertering af en Ct-værdi til et udskriftskopinummer.
For at evaluere analysens ydeevne kræves der kontrolprøver, herunder en reference gDNA og en calibrator plasmid. Referencegenomic materiale er en samlet blodprøve fra flere donorer med kendte immuncellefrekvenser og bruges til en kvalitetskontrol (QC) analyse ydeevne kontrol. Kalibratorprøven er en syntetiseret plasmid, der indeholder CD8-, FoxP3- og GAPDH-gensekvenserne i et ækvimolarforhold. Det anvendes som et mål for bisulfitkonverteringseffektiviteten, fordi bisulfitkonverteringer inden for forskellige genomiske regioner vil variere i effektivitet. Forholdet mellem målet og GAPDH i kalibratoren er 1, men på grund af forskelle i bisulfitkonverteringseffektiviteten kan forholdet variere. Denne kalibreringsfaktor påføres CD8- og Treg-analyserne. FoxP3, genet, der anvendes i Treg assay, er placeret på X-kromosomet. Fordi denne analyse foranstaltninger kun umethylerede kopier af FoxP3, og kun én kopi af FoxP3 er umethyleret i Tregs, denne analyse er sex agnostiker og kan bruges med både mandlige og kvindelige prøver18. Th17-analysen anvender ikke en kalibratorprøve eller GAPDH som et rengøringsgen. I stedet medregnes et andet primersæt, der er rettet mod den methylerede loci, der findes i celler uden for Th17, og det samlede antal celler afspejles af summen af de methylerede og umethylerede kopier af IL-17. De data, der er hentet fra qPCR, indtastes i en forudindstillet analyseskabelon, der udfører kvalitetskontrol af dataene og beregner procentdelen af målcellen i startpopulationen. Dette giver automatiseret og upartisk dataanalyse, hvilket fjerner brugersubjektivitet og forbedrer standardiseringsfunktionerne.
Denne analyse bruger gDNA, som kan isoleres af en leukafomese procedure ved hjælp af dyrkede eller faste celler, eller frosne celle pellets. Det lave prøvekrav, fleksibilitet i prøveudgangsmaterialet, høj nøjagtighed og standardiseret analyse omhandler de begrænsninger, der er forbundet med flowcytometri, og er ideelle til kvalitetskontrol under udvikling af celleterapiprocesser.
Med fremkomsten af nye immunterapeutiske, der er behov for standardiserede metoder til at opdage immuncelle identitet og renhed. Vurderingsmetoder til in-process- og frigivelsestest, der er robuste, validerede og skalerbare, mangler at blive etableret og udgør en stor udfordring for kommercialiseringen af cellebaserede behandlinger. Mens flow cytometri er i øjeblikket den mest almindelige metode til immuncelle fænonopping, høj prøvekvalitet og mængde krav gør det vanskeligt for regelmæssig brug. Endvidere begrænses gennemførelsen af flowcytometri i et miljø med god fremstillingspraksis (GMP) af operatørafhængige gatingstrategier og kravet om referencestandarder for hver markør , der anvendes13,14. Selv om automatiseret gating har vist sig at forbedre analysen robusthed, er det endnu ikke en veletableret kvalitetskontrol strategi. Mens genekspression profilering også kan bruges til at karakterisere celleterapi produkt identitet og renhed, dataene er semikvantitative og arbejdskrævende. Derudover er RNA og microRNA relativt mindre stabile end DNA og kan bidrage til manglen på robuste og reproducerbare resultater. Således, udnytte epigenetiske DNA methylering status af en bestemt locus giver en stabil, nem at udføre, robust, og skalerbar metode til at identificere og kvantificere en celle type interesse.
Påvisning af methyleringsmønstre til fænotypeceller er afhængig af tre kritiske trin: For det første kræver analysen brug af gDNA, som isoleres efter de beskrevne metoder. Dna af høj kvalitet er påkrævet, og hvis det ikke anvendes, kan bisulfitomdannelse påvirkes23,24. Hvis der opnås DNA af lav kvalitet, anbefales yderligere rensning for at sikre analysens pålidelighed. For det andet er en vellykket bisulfit omdannelse af den umethylerede cytosin til uracil påkrævet. Det mest kritiske trin i bisulfitomdannelsen er DNA-denaturering23,25. Høj temperatur denaturering ved hjælp af ammonium bisulfit, i modsætning til natriumbisulfit, øger konvertering effektivitet og konsistens og er den anbefalede proces for disse analyser25,26. Brugerne skal sikre, at reaktionen sker ved 80 °C, og at prøveblandingen foretages hyppigt. Af disse grunde anbefales en digital termomixer (se Materialetabel). For det tredje skal korrekt pipetteringsteknik følges under qPCR-præparatet. Der kræves tre tekniske replikater under qPCR-reaktionen for at overholde minimumsoplysningerne for offentliggørelseaf kvantitative pcr-samarbejdsretningslinjer (Real-Time PCR). Det er acceptabelt, men ikke nødvendigt at medtage mere tekniske replikater. Forkert pipetteringsteknik og/eller ikke inklusive tekniske replikater vil føre til upålidelige qPCR-resultater.
Hvis de kritiske trin følges, og de ønskede resultater stadig ikke opnås, kan flere kontroller inden for analysen udnyttes til at lokalisere problemet. Korrekt bisulfit konvertering er det mest afgørende skridt i denne analyse. Forkert bisulfitkonvertering vil blive fremhævet af en mislykket kalibreringsfaktor og/eller referenceværdier beregnet af analyseskabelonen. Hvis bisulfitkonverteringen blev udført forkert (f.eks. hvis reaktionen blev udført på RT), ville der ikke være nogen forstærkning under qPCR. Der ville heller ikke blive set nogen forstærkning, hvis der blev begået en fejl under qPCR-reaktionsforberedelsen (f.eks. hvis qPCR-mastermixet ikke blev tilføjet). Disse to problemer kan adskilles ved at undersøge standardprøverne. Forstærkning i standardprøverne, men ikke reference-, kalibratoren og forsøgsprøverne, tyder på, at bisulfitomdannelsen ikke blev udført korrekt. Ingen forstærkning i nogen af prøverne tyder på, at qPCR ikke blev udført korrekt.
Mens denne analyse omhandler de strenge krav om prøve og analysevariation forbundet med andre fænonoponeringsmetoder, der specifikt flyder cytometri, er der begrænsninger, der skal bemærkes. Denne analyse er rettet mod en enkelt locus, der bruges som en entydig identifikator for målcellen, som forbyder multiplexed analyse, der er almindeligt udført med flow cytometri. Dette gør det vanskeligt at identificere komplekse celletyper som Th17. Brugen af methyleringsmønstre ved et enkelt locus har imidlertid vist sig at være en nøjagtig fænotypisk markør for flere celler og har været anvendt i flere kliniske forsøg15,16. Dette gælder især i Tregs, hvor vurdering foxp3 methylering signaturer er en nøjagtig og utvetydig metode til påvisning af sande Tregs fra forbigående FOXP3 udtrykke celler28. Tabet af multiplexed analyse opvejes af nøjagtigheden af loci afhørt. Fremtidige iterationer af analysen kunne omfatte flere qPCR farvestoffer og quenchers at give mulighed for påvisning af flere loci i en qPCR reaktion.
Denne analyse kan bruges som en alternativ metode til flow cytometri i bestemmelse af celle fænotype og identitet. Det skal bemærkes, at denne analyse ikke giver de nøjagtige værdier, som flow cytometri gør (Figur 1-3). Dette skyldes til dels variationen i dataanalyse i forbindelse med flowcytometri. Afhængigt af gating strategi, resultater fra flow cytometri kan variere betydeligt. Dette er især tilfældet, når du bruger komplekse farvningsprotokoller til at se på intracellulære mål, såsom IL-17, hvor variationskoefficienten (CV) kan være helt op til 15 %14. Mellem flere brugere, analysen præsenteret konsekvent havde et CV på <15%, støtte robusthed af analysen og forbedret standardisering kapaciteter. De største forskelle mellem epigenetisk og flow cytometri-baseret fænosotning ses, når cellestimulation er påkrævet (Figur 3). Påvisning af Th17-celler via flowcytometri blev udført ved hjælp af en fælles protokol for T-cellestimulering og intracellulær cytokinfarvning29,30,31. Forskellene i Th17 fænosod mellem epigenetisk måling og flow cytometri kunne skyldes kinetik il-17 produktion. Mens methyleringssignaturerne er stabile, tager proteinproduktionen tid og skal være til stede i tilstrækkelige mængder til at blive påvist ved fluorescerende antistoffer20,32. Det kan være nødvendigt at udvide den 6 timers inkubation med proteintransporthæmmer og cellestimuleringscocktail for at se niveauet af Th17-celler, der er påvist via epigenetiske-baserede fænosotningsmetoder. Flere undersøgelser er nødvendige for at bestemme den præcise årsag til, at værdierne ikke stemmer overens, og bestemmer den mest nøjagtige fænonoptosende metode.
I denne rapport beskriver vi, hvordan man identificerer og kvantificerer immuncelletyper i en heterogen blanding af celler på en enkel og robust måde. Analyserne er designet og optimeret til potentiel brug til in-process og release test af celle-baserede terapeutiske. De beskrevne analyser opfylder kravet om, at højt kvalificerede råvarer skal anvendes i celleterapi applikationer. Ved at afhjælpe manglerne ved flow cytometri og andre molekylære metoder såsom stabilitet, prøvekrav, forudgående stimulation, cellulær permeabilisering for intracellulær farvning, og subjektivitet dataanalyse, er de beskrevne analyser i overensstemmelse med målene om kommercialisering af cellebaserede behandlinger.
The authors have nothing to disclose.
Projektet blev finansieret af Thermo Fisher Scientific Intramural tilskud.
2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |