Измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала в гематопоитических стволовых клетках и Т-клетках по цитометрии потока
Summary
Здесь мы описываем надежный метод измерения митохондриальной массы и мембранного потенциала в ex vivo культивированных гематопоитических стволовых клетках и Т-клетках.
Abstract
Тонкий баланс покоя, самообновления и дифференциации является ключом к сохранению гематопоитической стволовых клеток (HSC) бассейн и поддерживать пожизненное производство всех зрелых клеток крови. В последние годы клеточный метаболизм стал важнейшим регулятором функции и судьбы HSC. Ранее мы продемонстрировали, что модуляция митохондриального метаболизма влияет на судьбу HSC. В частности, путем химического разъединения цепи транспортировки электронов мы смогли сохранить функцию HSC в культурных условиях, которые обычно вызывают быструю дифференциацию. Однако ограничение числа HSC часто исключает использование стандартных анализов для измерения метаболизма HSC и, следовательно, прогнозирования их функции. Здесь мы сообщаем о простом анализе цитометрии потока, который позволяет надежно измерять потенциал митохондриальной мембраны и митохондриальной массы в дефицитных клетках, таких как ГХК. Мы обсуждаем изоляцию ГХК от костного мозга мыши и измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала после экс-виво культуры. В качестве примера мы показываем модуляцию этих параметров в ГХК с помощью лечения метаболическим модулятором. Кроме того, мы расширяем применение этой методологии на периферической крови человека полученных Т-клеток и опухоли человека проникают лимфоцитов (TILs), показывая значительные различия в их митохондриальных профилей, возможно, отражая различные Т-клетки Функциональность. Мы считаем, что этот анализ может быть использован в скринингах для выявления модуляторов митохондриального метаболизма в различных типах клеток в различных контекстах.
Introduction
Гематопоитические стволовые клетки (ГСК) представляют собой небольшую популяцию клеток, проживающих в костном мозге, обеспечивающих выработку крови и гомеостаза на протяжении всей жизни организма. HSCs посредника этот процесс, порождая прародителей, которые, в свою очередь, производят неизлечимо дифференцированных зрелых линий клеток крови через несколько раундов деления клеток и хорошо организованных шагов дифференциации1. Важно отметить, что HSCs производят свою энергию с помощью анаэробного гликолиза. В отличие от этого, более совершенные и активные гематопоитетические прародители переключают свой метаболизм в сторону митохондриального метаболизма2,3,4. Это четкое метаболическое состояние, как полагают, для защиты HSCs от клеточного повреждения, нанесенного реактивных видов кислорода (ROS), производимых активными митохондриями, тем самым сохраняя их долгосрочные функции in vivo5,6,7,8. Прямое измерение метаболического состояния HSC является сложной задачей и часто низкой пропускной всей связи из-за их ограниченного числа. Здесь мы описываем поток цитометрии на основе анализ для надежного измерения митохондриальной мембраны потенциал (зм) с использованием тетраметилходамамина метил-эфира (TMRM) флуоресценции, и митохондриальной массы с использованием зеленого флуоресцентного митохондриального пятна (MitoGreentracker) в HSCs. Ранее мы продемонстрировали, что низкий йм является добросовестным функциональным маркером высокоочищенных HSCs9 и метаболических модуляторов, способных снижать зм повышения функции HSCs9,10. Здесь мы предлагаем использовать наш метод на HSCs митохондриального профилирования в качестве стратегии для выявления новых молекул, способных улучшить долгосрочный потенциал восстановления крови HSCs.
В качестве примера мы демонстрируем, что этот асссеможно достоверно измеряет снижение HSC-m при воздействии витамина B3 аналогового никотинамида рибозида (NR). Соответственно, в нашем недавно опубликованном исследовании мы демонстрируем, что NR сильно улучшает восстановление крови посттрансплантации в мышиных и гуманизированных систем мыши путем непосредственного улучшения гематопоэтиных стволовых и прародителей функций10. Емкость таких метаболических модуляторов имеет большое клиническое значение, учитывая, что 25% смертности связано с задержкой в крови и иммунного восстановления у пациентов после трансплантации11,12.
Кроме того, мы предоставляем доказательства того, что эта методология может быть применена для характеристики метаболического профиля и функции т-клеток человека. В последние годы, развитие приемной клеточной терапии (ACT) с использованием аутологичных опухолей инфильтрации лимфоцитов (TILs) стала наиболее эффективным подходом для некоторых видов запущенного рака с крайне неблагоприятным прогнозом (например, метастатической меланомы, где йgt;50% пациентов реагируют на лечение и до 24% пациентов имеют полную регрессию)13. Тем не менее, TILs укрывательство достаточной противоопухолевой активности трудно генерировать14. Обширное пролиферация и стимуляция, что TILs проходят во время расширения ex vivo причиной истощения Т-клеток и сенесценции, которые резко ухудшают противоопухолевую реакцию Т-клеток15. Важно отметить, что противоопухолевые способности TILs тесно связаны с ихметаболизмом 16,17 и подходы, направленные на модулирование метаболизма через ингибирование PI3K/ Akt путь дали обнадеживающие результаты18,19. По этой причине мы сравниваем м-м Т-клеток, полученных из периферических моноядерных клеток крови (ПБМК) и ТЭЛ, полученных от пациента, и показываемому, что менее дифференцированные Т-клетки, полученные из PBMC, имеют более низкую и митохондриальную массу по сравнению с неизлечимо дифференцированными Тилами.
Мы предвидим, что этот асссможно использовать для определения новых метаболических модуляторов, которые улучшают функцию HSC и Т-клеток с помощью модуляции км.
Protocol
Representative Results
Discussion
Строгое регулирование функции HSC важно для поддержания стабильного гематопоеза в течение жизни организма. Как и различные другие типы клеток в организме, ключевым компонентом, который способствует регуляции функции HSC является клеточный метаболизм. Предыдущие исследования из нашей л?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим основной фонд ЦИтометрии UNIL Flow за их поддержку, особенно д-ра Ромена Беделя. Эта работа была поддержана грантом Фонда Кристиана Герхарда Джебсена N.V и O.N.
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Recherche en cancérologie. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
