Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi
Summary
Burada ex vivo kültürlü hematopoetik kök hücreler ve T hücrelerinde mitokondriyal kitle ve membran potansiyelini ölçmek için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Quiescence ince bir denge, kendini yenileme, ve farklılaşma hematopoetik kök hücre korumak için anahtar (HSC) havuzu ve tüm olgun kan hücrelerinin ömür boyu üretimini korumak. Son yıllarda hücresel metabolizma HSC fonksiyonu ve kaderinin önemli bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. Daha önce mitokondriyal metabolizma modülasyonunun HSC kaderini etkilediğini göstermiştir. Özellikle, elektron taşıma zincirini kimyasal olarak ayırarak hsc işlevini normalde hızlı farklılaşmaya neden olan kültür koşullarında sürdürebildik. Ancak, HSC sayılarını sınırlamak genellikle HSC metabolizmasını ölçmek ve bu nedenle işlevlerini tahmin etmek için standart tahlillerin kullanılmasını engellemez. Burada, HSC’ler gibi kıt hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin ve mitokondriyal kitlenin güvenilir ölçümüne olanak tanıyan basit bir akış sitometri sitometrisi tayini sitoz raporu. HSC’lerin fare kemik iliğinden izolasyonu ve mitokondriyal kütle ve membran potansiyeli post ex vivo kültürünün ölçülmesi tartışılmaktadır. Örnek olarak, metabolik modülatör ile tedavi yoluyla HSC’lerde bu parametrelerin modülasyon göstermek. Ayrıca, insan periferik kan türetilmiş T hücreleri ve insan tümörü lenfositler (TILs) infiltrasyon, onların mitokondriyal profillerinde dramatik farklılıklar gösteren, muhtemelen farklı T hücre yansıtan bu metodolojinin uygulama genişletmek Işlevsel -liği. Bu töbyenin farklı bağlamlarda çeşitli hücre tiplerinde mitokondriyal metabolizmamodülatörlerini belirlemek için yapılan taramalarda işe yadabileceğine inanıyoruz.
Introduction
Hematopoetik kök hücreler (HSCs) bir organizmanın ömrü boyunca kan üretimi ve homeostaz sağlayan kemik iliğinde yaşayan hücrelerin küçük bir popülasyonvardır. HSC’ler bu süreci, hücre bölünmesi ve iyi düzenlenmiş farklılaşma adımları1ile ölümcül farklılaşmış olgun kan hücresi soyları üreten atalara yol açarak aracılık etmektedir. Daha da önemlisi, HSC’ler enerjilerini anaerobik glikoli yoluyla üretirler. Buna karşılık, daha kararlı ve aktif hematopoetik atalar mitokondriyal metabolizma doğru metabolizmageçiş2,3,4. Bu farklı metabolik durum aktif mitokondri tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücresel hasara karşı HSC’leri korumak için inanılmaktadır, böylece in vivo fonksiyonuuzunvadeli korumak 5,6,7,8. HSC metabolik durumunun doğrudan ölçümü, sınırlı sayıdan dolayı zordur ve genellikle düşük iş üretimidir. Burada, tetrametilloidamin metil ester (TMRM) floresan kullanarak mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔM) sağlam ölçümü için akış sitometri sitometrisi esaslı bir test ve HSC’lerde yeşil floresan mitokondriyal leke (Mitotrackerrül) kullanılarak mitokondriyal kütleyi tanımlıyoruz. Daha önce düşük ΔSm son derece saflaştırılmış HSCs iyi niyetli fonksiyonel belirteç olduğunu göstermiştir9 ve metabolik modülatörler ΔSC fonksiyonu geliştirmekgeliştirmek 9,10. Burada, HSC’lerin uzun vadeli kan yeniden yapılanma potansiyelini geliştirebilen yeni molekülleri belirlemek için strateji olarak HSC’ler mitokondriyal profilleme yöntemimizi kullanmayı öneriyoruz.
Örnek olarak, b3 vitamini analog nikotinr riboside (NR) maruz kaldıktan sonra bu titreşinin HSC ΔSm’nin alçaltMasını güvenilir bir şekilde ölçtettiğini gösteriyoruz. Buna göre, yakın zamanda yayınlanan çalışmamızda NR’nin hem fare hem de insanlaştırılmış fare sistemlerinde kan kurtarma sonrası naklini doğrudan hematopoetik kök ve ata fonksiyonlarını geliştirerek güçlü bir şekilde iyileştirdiğini gösteriyoruz10. Bu tür metabolik modülatörlerin kapasitesi, nakledilen hastalarda %25’lik bir ölüm oranının kandaki gecikmeye ve immün iyileşmeye bağlı olduğu düşünülürse klinik değeri yüksektir11,12.
Ayrıca, bu metodolojinin insan T hücrelerinin metabolik profilinin ve fonksiyonunun karakterizasyonu için uygulanabildiği kanıtlarını saklı tmaktadır. Son yıllarda, otolog tümör infiltrasyon lenfositler (TILs) kullanarak benimseyen hücre tedavisi (ACT) gelişimi son derece olumsuz prognoz ile ileri kanser bazı türleri için en etkili yaklaşım haline gelmiştir (örneğin, metastatik melanom, nerede >50% hastaların tedaviye yanıt ve hastaların% 24 kadar tam regresyon var)13. Ancak, yeterli antitümör aktivitesi barındıran TILs oluşturmak zordur14. TILs ex vivo genişleme sırasında geçmesi geniş proliferasyon ve stimülasyon T hücre yorgunluğu ve önemli ölçüde T hücre antitümör yanıtı bozan senescence neden15. Daha da önemlisi, TILs ‘antitümöral kapasitesi sıkıcametabolizma16bağlı,17 ve PI3K / Akt yolunun inhibisyonu ile metabolizma modüle amaçlayan yaklaşımlar cesaret verici sonuçlar üretti18,19. Bu nedenle periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) ve hasta kaynaklı TIL’lerden elde edilen T hücrelerinin ΔMm’sini karşılaştırıyoruz ve daha az diferansiye PBMC türetilmiş T hücrelerinin ölümcül farklılaştırılmış TIL’lere kıyasla δM ve mitokondriyal kütleye sahip olduğunu gösteriyoruz.
Bu tözün, ΔDm modülasyonu ile HSC ve T hücre fonksiyonunu iyileştiren yeni metabolik modülatörleri tanımlamak için kullanılabileceğini öngörüyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
HSC fonksiyonunun sıkı bir düzenleme bir organizmanın ömrü boyunca istikrarlı hematopoiesis korumak için önemlidir. Vücuttaki diğer çeşitli hücre tipleri gibi, HSC fonksiyonunun düzenlenmesine katkıda bulunan önemli bir bileşen hücre metabolizmasitir. Bizim laboratuvar9 ve diğerleri2öncekiçalışmalardamitokondri hscs ayrı bir metabolik devlet bakımında önemini ima var. İdris kemik iliği izole HSC’lerin son derece düşük sayıda nede…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ÖZELLIKLE Dr. Romain Bedel’e verdikleri destekten dolayı UNIL Flow Sitometri Çekirdek Tesisi’ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Kristian Gerhard Jebsen vakfının N.V ve O.N.’ye verdiği bağışla desteklenmiştir.
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Recherche en cancérologie. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
