Neutrala SO2 kluster av låg kinetisk energi (< 0,8 eV/komponent) används för att desorb komplexa ytmolekyler såsom peptider eller lipider för vidare analys med hjälp av masspektrometri med hjälp av en jonfälla masspektrometer. Ingen särskild provberedning krävs, och realtidsobservation av reaktioner är möjlig.
Desorption/Jonisering Induceras av neutrala SO2 Clusters (DINeC) används som en mycket mjuk och effektiv desorption/joniseringsteknik för masspektrometri (MS) av komplexa molekyler och deras reaktioner på ytor. DINeC är baserat på en stråle av SO2-kluster som påverkar provytan vid låg klusterenergi. Under kluster-ytan inverkan, några av ytan molekyler är desorbed och joniserade via dissolvation i den påverkar klustret; Som ett resultat av denna dissolvation-medierad desorption mekanism, låg klusterenergi är tillräcklig och desorption processen är extremt mjuk. Både ytadsorbater och molekyler som ytan består av kan analyseras. Tydliga och fragmenteringsfria spektra från komplexa molekyler som peptider och proteiner erhålls. DINeC kräver ingen särskild provberedning, särskilt ingen matris behöver tillämpas. Metoden ger kvantitativ information om provernas sammansättning. molekyler vid en yttäckning så låg som 0,1 % av ett monoskikt kan detekteras. Ytreaktioner som H/D-utbyte eller termisk nedbrytning kan observeras i realtid och reaktionernas kinetik kan härledas. Med hjälp av ett pulsat munstycke för klusterstrålegenerering kan DINeC effektivt kombineras med jonfällamasspektrometri. DINeC-processens matrisfria och mjuka karaktär i kombination med msn-kapaciteten hos jonfällan möjliggör en mycket detaljerad och entydig analys av den kemiska sammansättningen av komplexa organiska prover och organiska adsorbater på ytor.
Ytkänsliga analystekniker baseras ofta på partikelsonder som lågenergielektroner, atomer eller joner som starkt interagerar med fasta prover. Som en följd av detta visar de hög ytkänslighet och detaljerad information om ytstruktur kan erhållas1. Kemisk information är dock ofta begränsad. Som ett exempel kan röntgenfotoelektronsspektroskopi ge kvantitativ information om atomsammansättningen och den genomsnittliga kemiska miljön hos en viss art (t.ex. kolatomer i en organisk molekyl adsorbed på en yta2). Mer detaljerad information om komplexa, ytannonserorbedmolekyler, såsom deras detaljerade struktur eller bindningsplatser, är dock svårt att erhålla med standardtekniker för ytanalys. Å andra sidan ökar behovet av sådan information med det ökande intresset för ytfunktionisering med hjälp av organiska molekyler. De expanderande fälten för syntes på ytan3 eller ytfunktionalisering genom fastsättning av biomolekyler4,5 är två framträdande exempel. Inom alla dessa områden undersöks grundläggande frågor om substratannonserorbate och adsorbat-adsorbatinteraktioner för att bättre förstå systemen. För dessa undersökningar är det önskvärt med högst information om adsorbedmolekylerna.
Delvis kan sekundär jonmasspektrometri (SIMS) ge sådan information. För det första är SIMS mycket ytkänsliga. För det andra, eftersom spottade adsorbater och deras fragment upptäcks med hjälp av MS, information långt bortom atomsammansättning erhålls. Beroende på artens art kan den identifieras genom dess molekylära massa och fragmentmönster som observerats i massspektrumet6. De fragment som orsakas av de primära jonerna kan verkligen hjälpa till att identifiera det analyserade materialet. Å andra sidan, om primärjoninducerad modifiering (fragmentering, joninducerade reaktioner, blandning) av provet är för stark, är de flesta information om provets ursprungliga tillstånd förlorad. Således har stora ansträngningar gjorts för att minska fragmenteringen i SIMS (t.ex. med hjälp av laddade molekylära kluster som primära joner7,8,9). Fragmenteringen dominerar dock fortfarande SIMS-spektra av stora makromolekyler och biologiska prover10, vilket begränsar tillämpningen av SIMS inom olika områden.
Som ett alternativ har vi visat desorption /jonisering framkallas av neutrala kluster (DINeC) att vara en mjuk och matrisfri jonisering metod som framgångsrikt har använts för massa spektrometrisk analys av komplexa molekyler11,12 ,13,14,15,16,17. DINeC är baserad på en stråle av molekylära kluster som består av 103 till 104 SO2 molekyler (figur 1). När klustren påverkar provet interagerar de på olika sätt med molekylerna på och i ytan: för det första omfördelas en del av klustrets kinetiska energi och aktiverar desorption. Likaviktigt är desorbing molekylen upplöst i klustret under kluster-yta inverkan11,18,19(Figur 1 och figur 2). Med andra ord, baserat på den höga dipol ögonblick av SO2,kluster mycket effektivt fungera som en övergående matris för polaralyter. Som ett resultat sker desorption av analytmolekylerna vid klusterenergier så lågt som 1 eV/molekyl och nedan. Den mjuka karaktären av desorption processen stöds ytterligare av snabb kylning av systemet när SO2 klustret splittras under och efter ytan inverkan11,19. Som en följd av dessa olika aspekter, kluster-inducerad desorption av komplexa molekyler såsom peptider, proteiner, lipider och färgämnen fortsätter utan någon fragmentering av desorbingmolekylerna 11,15; typisk massa spektra visar den dominerande toppen på m / z värdet av intakt molekyl ([M + H]+ eller [M-H]–, Figur 3). Beroende på antalet funktionella grupper i molekylen, flera laddade katjoner av formen [M + n· H]n+ observeras11,15,18. För biomolekyler sker jonisering vanligtvis via upptag eller abstraktion av en proton vid en grundläggande eller sur funktionell grupp, respektive11. Om vattenmolekyler finns i provet, SO2 molekyler från klustret kan reagera med dessa vattenmolekyler bildar svavelsyra18. Den senare kan fungera som en effektiv protonkälla som ytterligare främjar joniseringsprocessen vid jonisering via protonupptag (positivt jonläge)13,18.
Bild 1: Schematisk illustration av klusterinducerad desorption/jonisering och experimentell inställning. Klusterinducerad desorption/jonisering utförs i ett högvakuumkärl. En stråle av SO2 kluster (gula prickar) produceras via överljudsfart expansion av en SO2/ Han gas blandning från ett pulsat munstycke. Under kluster-ytan inverkan, ytmolekyler är desorbed och joniserade. Molekylärjoner (röda/orange prickar) överförs via ett partiskt rutnät, en dubbel jontrattinlopp och octopolärjonsguider i jonfällan för masspektrometri. Typisk massa spektra visar dominerande toppar på m / z värden av intakta molekyler, här: M1 (orange) och M2 (röd) i positiv jon läge. Spränga: Under klusterytans påverkan löses desorbedmolekylerna upp i det slagkluster eller ett av dess fragment. Ytterligare omskakande och avdunstning av SO2 molekyler leder sedan till den nakna, intaktmolekylära jonen som detekteras i masspektrometern. Se även figur 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ögonblicksbilder av molekylära dynamiksimuleringar som illustrerar klusterinducerad desorption via dissolvation. (A) En SO2 kluster (300 molekyler) närmar sig ytan med 1250 m/s vinkelrätt mot ytan där en dipeptid (aspartic acid-arginin, ASP-ARG) är adsorbed. (B) Vid kluster-ytan-påverkan splittras klustret. Adsorbed dipeptid interagerar med de omgivande SO2 molekyler som leder till dess dissolvation i en av klustret fragment. (C) Klusterfragmenten stöts bort från ytan. Det märkta fragmentet (blå cirkel) bär dipeptid som är desorbed i detta fragment. Denna siffra har ändrats från referens 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativt massspektrum och molekylär modell av angiotensin II. (A) Masspektra (övre panelen: positiv jonläge, nedre panelen: negativjonläge) som erhålls efter klusterinducerad desorption/jonisering från ett angiotensin II-prov. Provet bereds genom att släppa respektive lösning på en Si-wafer (täckt av dess naturliga oxid). De viktigaste topparna tilldelas den intakta biomolekylen, [M+H]+ och [M-H]–; inga fragmenteringsmönster observeras. Dimers ([2M+H]+, pil) indikerar vidare den mjuka naturen av desorptionen processaa. Den positiva jonsignalen är mer intensiv på grund av påverkan av SO2 kluster18. (B) Modell för utrymmesfyllning och aminosyrasekvens av angiotensin II. Vita bollar indikerar väteatomer; svart: kol; Blå: kväve; röd: syre. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
DINeC kan appliceras på alla typer av fast prov som är kompatibel med högvakuumförhållanden. Ingen särskild provberedning krävs, särskilt ingen matris behöver tillämpas före Mätningarna av DINeC-MS, i motsats till matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI) masspektrometri och tillhörande tekniker20,21. Detta möjliggör realtidsmätningar av kemiska förändringar av provet med varierande experimentella förhållanden såsom bakgrundstryck av reaktiva arter i vakuumkammaren22 eller provtemperaturen. Detektionsgränsen för DINeC-MS har visat sig vara i femtomolintervallet11. När den applicerades på analysen av biomolekyler adsorbed på fasta ytor i undermonolayer regimen, en yta täckning så lågt som 0,1% av ett monolayer upptäcktes23. I detta täckningssystem beror signalintensiteten linjärt på yttäckningen och DINeC-MS kan användas för kvantitativ analys av ytsammansättningen23. När det gäller blandade prover är en kvantitativ utvärdering av provsammansättningen möjlig17,24, eftersom det inte observeras någon större effekt av den kemiska miljön på joniseringssannolikheten (t.ex. när det gäller blandade lipid-/peptidprover17). Detta står i tydlig kontrast till SIMS, för vilka joniseringssannolikheten för en viss art vanligtvis påverkas starkt av förekomsten av olika kemiska komponenter (den så kallade “matriseffekten”25,26).
Förutom ytanalys kan kemisk sammansättning i området under ytan undersökas med hjälp av djupprofilering17. Med den aktuella uppsättningen är typiska desorption-frekvenser av klusterinducerad desorption av biomolekyler av ordningen 10-3 nm/s. En hög djupupplösning i intervallet 1 till 2 nm har observerats för blandade lipid-/peptidprover17.
Ett annat användningsområde är kombinationen av DINeC-MS med tunn skiktkromatografi (TLC). Konventionella TLC-plattor kan analyseras direkt med hjälp av DINeC-MS. Positionsberoende massspektra kan förvärvas från TLC-plattorna och därmed massspecifika kromatogram kan erhållas från TLC-plattorna27. Ingen omelläggning av de separerade analyterna är nödvändig, annorlunda än TLC i kombination med ESI28,29. Ingen matris behövs för DINeC-MS + TLC-kombinationen heller, i motsats till kopplingen mellan TLC med MALDI28,29.
Desorption elektrosprayjonisering (DESI) är också en mjuk desorption /joniseringmetod för MS-applikationer30,31. De mest slående skillnaderna mellan DINeC och DESI är: DINeC23:skvantitativa karaktär, dess kompatibilitet med uhv-förhållanden (Ultra-high-vacuum), särskilt möjligheten att undersöka prover som utarbetats och överförts under UHV-förhållanden utan att brytavakuum23,samt möjligheten att effektivt desorb nonpolar molekyler19.
I princip kan DINeC som desorption/joniseringskälla kopplas till alla typer av masspektrometer. Kombinationen med jonfälla massa spektrometri har dock två huvudsakliga fördelar: för det första motsvarar pulsbredden och upprepningshastigheten hos en typisk pulsade klusterstråle mycket bra till den diskontinuerliga ackumuleringstiden samt jonfällans spektrala hastighet15,32. För det andra leder den mjuka karaktären av DINeC-processen till desorption av intakta molekyler. I kombination med MSn kapacitet jonfälla massa pektrometri, detta möjliggör en mest omfattande analys av de undersökta proverna15.
I många studier hittills har en hög känslighet hos DINeC-MS på olika ämnen påvisats. Detta gör det faktiskt möjligt att mäta analyter ner till en mängd ämne i femtomolregimen11. På grund av denna höga känslighet måste provberedning, särskilt substratrengöring, utföras med mycket rena kemikalier för att undvika kontaminering i DINeC-massspektrat. Eftersom det är fallet för många analystekniker hjälper en korrekt bakgrundsmätning från ett tomt substrat att separera toppar från analyten och toppar som har sitt ursprung i substrat-/provberedning.
Även om vi har visat att joniseringssannolikheten för en viss analytmolekyl inte påverkas starkt av närvaron av co-adsorbater eller sambeståndsdelar i blandade prover17,24,kan joniseringssannolikheten variera från substans till ämne13. Således är det ännu viktigare att arbeta under rena förhållanden som föroreningar, beroende på deras jonisering sannolikhet, kan bidra till signalen mycket starkare än analyten. Förformade joner (t.ex. som finns i fallet med många färgämnesmolekyler) eller molekyler med funktionella grupper som visar en tydlig tendens till protonupptag eller deprotonisering (dvs. baser eller syror), visar vanligtvis hög joniseringssannolikhet i DINeC-MS. Om ingen sådan funktionell grupp finns i analyten kan joniseringssannolikheten vara låg. Proverna kan sedan behandlas med joniserande ämnen som trifluorsyra (t.ex. genom exponering av provet på joniserande medlets ångtryck).
De representativa resultat som diskuteras i figur 4 och figur 5 visar att DINeC-MS är tillämplig t.ex. Figur 6 illustrerar metodens undermonolayer-känslighet. Om de två egenskaperna kombineras kan kemiska reaktioner på ytor och deras produkter följas i realtid23. Detta kan vara särskilt av intresse för så kallad “on-surface syntes” som leder till montering av makromolekylära strukturer på ytor3,33,34,35,36. I den nuvarande uppsättningen är observationen av sådana ytreaktioner möjlig på ytor med lägre reaktivitet såsom guld23 och andra ädla metaller. Experimenten är svårare att utföras på mycket reaktiva ytor som kiselytor37, eftersom bastrycket i desorptionkammaren är i 10 -7-mbar-området. Aktuella aktiviteter tar itu med denna begränsning och en UHV-kompatibel DINeC-apparat håller på att byggas upp. När det gäller reaktiva ytor måste interaktionen mellan SO2 och substratytan testas före mätningarna av ytadsorbater och ytreaktioner.
Eftersom klusterstrålen är neutral kan den inte fokuseras. Strålstorleken på provet ges således av geometrin hos den använda skimmern. typiska värden för stråldiametern på provet är en till flera millimeter. Som ett resultat är det endast möjligt att skanna provet med mycket låg upplösning. Å andra sidan, ges av den höga jonisering sannolikhet13, DINeC effektivt använder sig av desorbed molekyler. Således verkar en kombination av DINeC-MS och en jon-imaging detektor38 vara mycket attraktiv.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) och Helmholtz Graduate School for Hadron och Ion Research (P.S.). Författarna tackar Professor Rauschenbach (University of Oxford) och hans team för givande samarbete på kombinerade ES-IBD/DINeC experiment.
Acetone rotisolv HPLC | Roth | 7328.2 | HPLC Gradient Grade |
Copper tape | |||
Ethanol rotisolv HPLC | Roth | p076.1 | HPLC Gradient Grade |
Helium | Praxair | 4800086706 | Purity 99.9999% |
Nitrogen | Praxair | 40728408 | Purity 99.5 – 100% |
Silicon Wafers | Active Business Company GmbH | G60007 | |
Sulfur dioxide | Air Liquide | P1734S10R0A001 | Purity 99.98% |
Water rotisolv LC-MS | Roth | HN43.1 | Ultra LC-MS |