エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体は、マイクロリットル体積液滴の見かけの接触角の電圧駆動変化を利用して、その操作を容易にする技術です。これを機能化された磁気ビーズと組み合わせることで、酵素結合免疫測定アッセイ(ELISA)を用いた複数の実験ユニット操作を組み合わせて、サンプル調製と病原体の同定を可能にします。
エレクトロウェッティングは、表面電荷に露出した液滴の接触角を変更する効果です。エレクトロウェッティングオン誘電体(EWOD)は、薄い絶縁体フィルムの誘電特性を利用して電荷密度を高め、電気濡れ効果を高めます。電荷の存在は、疎水性表面全体に意図的な操作を可能にする液滴の電気的に誘発された広がりをもたらす。ここでは、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)法の2種類を用いて、自動表面作動プラットフォームを用いて、4つのカテゴリーの抗原のサンプル処理と検出のためのEWODベースのプロトコルを実証する。ELISAは、特定の抗原を標的に選択できる固定化一次抗体を用いて磁気ビーズに対して行われる。HRPに結合した抗体は抗原に結合し、捕捉された病原体の定量のためにH2O2/ルミノールと混合される。6~10分の間のアッセイ完了時間が達成され、試薬の体積は微量に利用された。
この提案された方法は、デジタルマイクロ流体(DMF)および磁気泳動分離を用いたEWODベースのアプローチを用いた抗原の定量的検出を用いたELISAの自動サンプル調製を容易にすることを目的とする。DMFが磁気ペーシスと組み合わせて、液体処理用途1に対する興味深い代替手段であることを複数の生物学的用途に対して実証されている。より具体的には、病原体の検出は、多くの分野において暗黙の側面であり、医療2から農業、環境3、4、国家安全保障5に至るまでである。病原体の脅威に対処できる検出技術は、高スループット(例えば、短時間のアッセイ時間)、効率(検出の低い限界 – LoD – と高感度)、および機能性6に対する特異性(標的病原体タイプ)を備えている必要があります。
これまで、EWODベースのDMFは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、抗生物質耐性病原体(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌またはMRSA)の検出、M.肺炎およびC.albicansに低予算のプリント基板チップと磁気opess7を使用して正常に実装されてきた。この技術は、ピローズケンシングおよび化学発光検出8を介したデオキシリボ核酸(DNA)変異の検出にも適用した。EWODベースのプラットフォームは、免疫測定アプリケーションの機能性も拡大し、単一の統合プラットフォーム内で同時にサンプルの回収と検出を可能にします。例えば、単一のEWODチップ設計は、全血サンプルからの心臓トロポニンIのビーズベースの免疫アッセイとMRSA検出のための別の実験RT-PCRの両方に対するポイントオブケアテストのためのDMFプラットフォームで成功を実証した。このチップは、液滴の蒸発を防止し、ナノリットルのボリュームの信頼性の高い自動操作を容易にする油フィラーを利用しています。多目的なバイオアプリケーションは、アッセイパラメータ最適化のための実験(DoE)試験の設計を含む、定量的均質および不均一な免疫アッセイ9、10をカバーする同様のDMFアプローチの実施と共に調査された。
微量の作業量による強化を処理する明らかなメリットにもかかわらず、油で満たされたDMFプラットフォームは困難であり、操作には一定の専門知識が必要です。油入れシステムは、密閉された部品を必要とするため、システムの輸送性が重要な特定の現場での用途には理想的ではありません。さらに、ZhaoおよびCho12、ヨンソン・ニジョウカら、Foatら14によって提案されたような表面上の乾燥材料収集を利用して、いくつかの特定の用途に使用することは不可能でない場合、油系システムは非常に困難であろう。これに対し、オイルフリーシステムは統合が簡単で、チップツーチップのサンプル翻訳が容易なという利点があります。これらの理由から、提案された方法は、油を必要としないDMFにEWODベースの免疫アッセイを提供し、効果的にデバイス操作を簡素化するために開発されました。
この貢献では、イムノアッセイのためのオーダーメイドの自立型完全自動DMFプラットフォームの使用について報告し、生体分子の迅速な検出のためのプロトコル、すなわちタンパク質、栄養細菌、細菌胞子およびウイルスについて詳しく説明します。EWODチップと磁性粒子の組み合わせにより、サンプル調製および免疫沈降を自動化し、さらに不一致のMS測定15を用いて実証されている。最近、はしかおよび風疹IgGに対する現場診断は、ウィーラーグループ16によってケニア北西部の遠隔地の人口で実証されている。ウィーラーと私たちのシステムの両方が、輸送可能で自己完結型であり、オンチップ、リアルタイムの化学発光測定を含めて完全に自動化され、利用可能な最も先進的なDMFバイオ検出システムの中で間違いなくです。
2つのシステムは非常に異なった適用を念頭に置いて設計されていた。ウィーラーのシステムは、バイオマーカーをターゲットにして患者にバイオメディカル診断を可能にしますが、バイオ検出システムは、以前に空気からサンプリングされた病原体を直接検出するための防御要件に基づいて構築されています。両者の類似性は、EWODベースの技術が影響を与えることができる生命に影響を与えるセクターの広い範囲を示す液滴作動の根底にある原則です。すなわち、DMFベースの検出プラットフォームと関連するEWODシステムは、健康(生物医学的診断)に重要な意味を見つけることができます。軍事および民間の保護(脅威の検出);アグリテック(作物モニタリング)と作業安全(制御環境モニタリング)
当社のDMFプラットフォームの性能は、ヒト血清アルブミン(HSA、球状タンパク質)、大腸菌(大腸菌、栄養細菌)、バチルスアトロファエウス(BG、細菌胞)およびMS2(バクテリオファージウイルス)の完全自動検出に対して評価されます。さらに重要なことに、提案されたDMF法は、捕獲抗体を交換して、この記事で考慮されている4つの抗原とは異なる他の抗原の検出を標的にすることができるという意味で非常に汎用性がある。抗体ベースのセンシングを完全に回避すると、DMFプラットフォームは、磁気ビーズがヌクレオチドの捕獲および/または検出のための特定のアプタマーを運ぶアプタマーバイオセンシングに基づいて潜在的なアプリケーションに構築することができます。高電圧波形発生器や駆動エレクトロニクスを含む統合された完全自収容型DMFプラットフォームを構成する異なるコンポーネントの設計と実現は、他の場所6に開示されている。
EWOD免疫測定プロトコルは柔軟であり、試薬の種類、安定性およびアッセイプロトコルによって定義される使用要件に応じて、様々な数の実験室単位操作(例えば、捕捉抗原、混合、インキュベーション、ビーズ抽出、洗浄)を含むことができる。原理の証明として、現在の記事では、2つの免疫測定プロトコルが、記載されたEWODチップを用いて8または10のLUOs(図4)の実装を示していると考えられる。このような微細化のメリットは、マイクロリットルから、試薬の使用量を両方減らすことによりELISAの有効性を増大させる試薬/検体の離散量、操作当たりの所要時間、本質的には、実験時間の合計(6〜10分)である。さらに、アッセイは、変動を減少させ、免疫測定法17の精度を向上させる液滴の時限操作で自動化される。現在の形式では、実験は各アッセイの開始時に液滴を手動で処理することを含み、これは次のセクションでのさらなる議論のポイントです。
現在のDMF法における重要なステップの1つは、液滴をEWODチップの表面に分配することです。通常、使い捨てチップを持つマイクロピペットは、正確な容積を測定し、それをロードするために使用されます。しかし、使い捨て先端の液滴と荷電面との相互作用のために、作動板の疎水性表面上の液滴を固定化することは困難になる可能性がある。その結果、液滴はプレート上に残るのではなく、先端の外側の表面に従って撃つことができます。これを避けるために、マイクロピペットは、チップ表面に垂直な直立位置に、それに触れることなく、液滴を表面に接触させることによってローディングパッドに分配する必要があります。液滴がピペットチップに付着した場合は、それをストック液に戻し、チップを交換し、新鮮な液滴を再デポジットします。現在の概念実証システムのさらなる発展において、液滴の自動送達が想定される。
もう一つの重要なステップは、アッセイを実行する前に、平行版アセンブリの蓋を閉じることである。プロトコルで前述したように、蓋は作動板の上に滑らなければなりません。ふたの疎水性表面は、作動板に座っている液滴の歪みおよび変位を防ぐ。液滴の滑らかな動きを保証するために、手付かずの作動板、液滴およびチップアセンブリの正しいローディングを使用することを強く推奨する。作動性の版の再利用性は可能である;しかし、サイクル数は、作動電圧(図3)および表面への検分/試薬堆積、別名バイオフロンに依存する。提示されたプラットフォームは、クロム印刷されたEWODチップを利用し、各実験後に120Vの動作電圧と中間プレート洗浄で最大4回の連続測定に確実に再利用することができました。プレートをリサイクルし、実験あたりのコストを削減するために、バイオファウルされた非晶質フルオロポリマー(材料表)コーティングを除染(完全にすすくう前に希釈されていない洗浄剤で表面をブラッシング)し、プレートの上に新鮮なものをスピンコーティングした。しかし、作動板のリサイクルには、手動処理、高価な試薬(アモルファスフルオロポリマー(材料表))および特殊な機器(スピンコーター)が必要です。代替EWODチップは、紙19、アセテートフィルムまたはプリント基板(PCB)20、21などのコスト効率の高い基板で正常に調査される。このような使い捨て消耗品は、DMFプラットフォームの信頼性の高い手頃な価格の使用を容易にし、バイオフッキングの問題を回避する手段を提供することができます。
バイオフリングは、生物学的用途のためのEWODの主な制限22,23である。DMFに関する以前の研究では、バイオフォーフェリングに寄与する2つのメカニズム、すなわち疎水性相互作用による受動吸着、および電界が適用されたときに現れる静電駆動吸着法24が同定された。現在の記事の知見は、高い作動電圧での作動性プレートの再利用性の低下を文書化したので、この理論と一致している。考えられる説明の1つは、タンパク質がフルオロポリマーコーティングされた(テフロン様)表面に容易に吸着し、手付かずの表面24と比較して汚れた上でより速く凝集することである。その結果、DMFに関するタンパク質関連アッセイは定量化が困難であり、検体の喪失、クロスコンタミネーション、および減少した精度17を経験する可能性がある。最悪のシナリオは、重要な量のタンパク質吸着がデバイスを役に立たないことを示す場合です。バイオファウリングを最小限に抑えるために、チップ上の液滴の滞留時間を最小限にすることから、コーティング23を通じて、生体材料を含む液滴6,22への添加剤(すなわち、界面活性剤またはプルロン酸)への様々なアプローチが検討されている。したがって、EWODのイムノアッセイアッセイの重要な側面は、目の前の特定のプロトコルと互換性のある抗バイオフロン戦略を選択することです。
自動DMFプラットフォームは、試薬と検物質の両方にマイクロリットルボリュームを使用しながら、1回の実行につき1つのサンドイッチELISAテストを実行するように設計されています。それが必要とされる場合、従来のサンドイッチELISAキットは、予備コーティングされた96ウェルまたは384ウェルプレートに基づいて存在し、補助実験装置と組み合わせて、1回あたりのスループットが高くなります。試薬価格のみに基づき、アッセイ/ウェルあたりの概算コストはそれぞれ6.04 USD (580 USD/96) および 0.33 USD (2×580 USD/384) です。これにより、一元化されたラボ施設で訓練を受けた技術者によって通常処理される多数のサンプルに最適な従来のELISA法が実現します。しかし、遠隔地では、環境モニタリングのためのELISAの詳細なコスト分析では、資本コスト(すなわち、実験室の運営コスト、繰り返しコスト、サンプル輸送、物資および人員)がELISA当たりの実際の価格が含まれ、そのうち34 USDはサンプル25あたり供給のためであった。対照的に、提案されたDMFプラットフォームはポータブルであり、操作するために最小限の訓練を必要とし、事前にコーティングされたビーズで数分でサンプルから回答の分析を提供することができる。したがって、提示された技術は、必要なポイントの場所に展開し、他の方法で集中研究所で利用可能な分析を補完することができます。
代表的な結果セクションでは、自動DMF免疫測定プラットフォームを防御用途の病原体の直接検出に使用しました。DMFプラットフォームの他の可能なアプリケーションは、バイオ診断、連続監視および自動サンプリングを包含するが、これらに限定されない。DMFは、パーソナライズされた医療のためのポイントオブケアから、空中病院取得感染からの患者の保護のための制御された環境監視、農業のための作物監視システム、および食糧生産。
The authors have nothing to disclose.
マイクロ流体・マイクロエンジニアリング研究グループの、機械設計とシステム統合に関する研究に関する協力を受けていただき、ご協力をお受けいたします。著者らは、DMF技術とそのアプリケーションをさらに発展させる過去および進行中のプロジェクトに対する、彼らの貴重な支援と財政的貢献に対するDstl Porton Downに感謝したいと思います。
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |