Le microfluidique numérique à base d’électrowetting est une technique qui utilise un changement de tension dans l’angle de contact apparent d’une gouttelette de volume de microlitre pour faciliter sa manipulation. La combinaison de ces perles magnétiques avec des perles magnétiques fonctionnalisées permet l’intégration de multiples opérations d’unité de laboratoire pour la préparation d’échantillons et l’identification d’agents pathogènes à l’aide d’analyses immunosorbent liées à l’enzyme (ELISA).
L’électrowetting est l’effet par lequel l’angle de contact d’une gouttelette exposée à une charge de surface est modifié. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploite les propriétés diélectriques des films d’isolants minces pour augmenter la densité de charge et donc stimuler l’effet d’électrowetting. La présence de charges entraîne une propagation électrique de la gouttelette qui permet une manipulation délibérée sur une surface hydrophobe. Ici, nous démontrons le protocole basé sur EWOD pour le traitement et la détection d’échantillons de quatre catégories d’antigènes, à l’aide d’une plate-forme automatisée d’actionnement de surface, via deux variantes d’un essai immunosorbent enzymatique (ELISA). L’ELISA est réalisée sur des perles magnétiques avec des anticorps primaires immobilisés qui peuvent être sélectionnés pour cibler un antigène spécifique. Un anticorps conjugué à HRP se lie à l’antigène et est mélangé avec H2O2/Luminol pour la quantification des agents pathogènes capturés. Des temps d’achèvement d’intervalle d’intervalle compris entre 6 et 10 min ont été atteints, tandis que de minuscules volumes de réactifs ont été utilisés.
La méthode proposée vise à faciliter la préparation automatisée des échantillons pour ELISA avec la détection quantitative des antigènes en utilisant l’approche basée sur eWOD avec microfluidique numérique (DMF) et la séparation magnétophore. Il a été démontré pour de multiples applications biologiques que DMF en combinaison avec la magnétophoresis est une alternative intéressante aux applications de manutention liquide1. Plus précisément, la détection d’agents pathogènes est un aspect implicite dans de nombreux secteurs, allant de la santé2 à l’agriculture et l’environnement3,4 à la sécurité nationale5. Une technologie de détection capable de faire face aux menaces des agents pathogènes doit comporter un débit élevé (p. ex. temps d’analyse court), une efficacité (faible limite de détection – LoD et une sensibilité élevée) et une spécificité (pour le type d’agent pathogène cible) pour qu’elle soit fonctionnelle6.
Auparavant, le DMF à base d’EWOD a été mis en œuvre avec succès pour la réaction en chaîne de polymère de transcription inversée (RT-PCR), la détection d’un agent pathogène résistant aux antibiotiques (Staphylococcus aureaus résistant à la méthicilline ou SARM), M.pneumonia et C.albicans à l’aide d’une puce à faible budget, imprimé à circuit imprimé et magnétothèse7. La technique a également été appliquée pour la détection des mutations de l’acide désoxyribonucléique (ADN) par pyrosequencing et détection chemiluminescente8. Les plates-formes basées sur EWOD étendent également leur fonctionnalité vers les applications immuno-analyse, permettant ainsi la récupération et la détection simultanées d’échantillons au sein d’une seule plate-forme intégrée. Par exemple, une seule conception de puce EWOD a été démontrée avec succès avec une plate-forme DMF pour les tests au point de service pour les deux immuno-tests à base de perles de la troponine cardiaque I à partir d’un échantillon de sang entier et comme une expérience distincte RT-PCR pour la détection du SARM2. Cette puce utilise le remplissage d’huile, qui empêche l’évaporation des gouttelettes et facilite la manipulation automatisée fiable des volumes de nanolitres. Des bioapplications polyvalentes ont été étudiées avec la mise en œuvre d’approches DMF similaires couvrant les immunosses quantitatives homogènes et hétérogènes9,10, y compris la conception d’expériences (DoE) études pour l’optimisation des paramètres d’analyse11.
Malgré ses mérites évidents pour traiter l’intensification due à des volumes de travail minuscules, une plate-forme Remplie d’huile DMF peut être difficile et nécessite un certain niveau d’expertise pour fonctionner. Les systèmes remplis d’huile, parce qu’ils nécessitent des composants scellés, ne sont pas idéaux pour certaines applications sur le terrain où la transportabilité du système est importante. En outre, un système à base d’huile serait très difficile, voire impossible à utiliser pour certaines applications spécifiques, profitant de la collecte de matériaux secs sur une surface telle que proposée par Zhao et Cho12, Junsson-Niedzi-ka et al.,13, et Foat et al.,14. En revanche, les systèmes sans huile sont simples à intégrer et ont l’avantage de fournir une traduction facile d’échantillons de puces à puce. Pour ces raisons, la méthode proposée a été développée pour fournir une immuno-réponse à base d’EWOD sur DMF qui ne nécessiterait pas d’huile, simplifiant efficacement le fonctionnement de l’appareil.
Dans cette contribution, nous rendons compte de l’utilisation d’une plate-forme DMF entièrement automatisée sur mesure, autonome et entièrement automatisée pour les immuno-analyses, et nous élaborons le protocole de détection rapide des biomolécules, à savoir : protéines, bactéries végétatives, spores bactériennes et virus. La combinaison de la puce EWOD avec des particules magnétiques pour la préparation automatisée de l’échantillon et l’immunoprécipitation a déjà été démontrée avec une mesure supplémentaire hors ligne de la SP15. Récemment, le diagnostic sur le terrain contre la rougeole et la rubéole IgG a été démontré dans la population éloignée du nord-ouest du Kenya par le groupe Wheeler16. Wheeler’s et notre système, étant transportable, autonome, entièrement automatisé avec des mesures chemiluminescentes en temps réel incluses sont sans doute parmi les systèmes de biodétection DMF les plus avancés disponibles.
Les deux systèmes ont été conçus avec des applications très différentes à l’esprit. Le système de Wheeler cible les biomarqueurs pour permettre le diagnostic biomédical sur les patients alors que notre système de biodétection est construit autour de l’exigence de défense pour la détection directe des agents pathogènes précédemment échantillonnés à partir de l’air. La similitude entre les deux est le principe sous-jacent de l’actionnement des gouttelettes, qui démontre le large éventail de secteurs qui influencent la vie que la technologie basée sur l’EWOD peut avoir un impact. À savoir, la plate-forme de détection basée sur Le DMF et le système EWOD associé pourraient trouver une incidence clé sur la santé (diagnostic biomédical); protection militaire et civile (détection des menaces); Agro-tech (surveillance des cultures) et sécurité au travail (surveillance contrôlée de l’environnement)
Les performances de notre plate-forme DMF sont évaluées par rapport à la détection entièrement automatisée de l’albumine du sérum humain (HSA, une protéine globulaire), Escherichia coli (E. coli, une bactérie végétative), Bacillus atrophaeus (BG, une spore bactérienne) et MS2 (un virus bactériophage). Plus important encore, la méthode DMF proposée est extrêmement polyvalente en ce sens que les anticorps de capture pourraient être échangés pour cibler la détection d’autres antigènes différents des quatre qui sont considérés dans cet article. Esquipassant entièrement la détection à base d’anticorps, la plate-forme DMF pourrait s’appuyer sur une application potentielle basée sur la biodétection des aptmères, où les perles magnétiques transportent des aptamères spécifiques pour la capture et/ou la détection des nucléotides. La conception et la réalisation des différents composants constituant la plate-forme Intégrée et entièrement autonome DMF, y compris le générateur de forme d’onde à haute tension et l’électronique d’entraînement est divulgué ailleurs6.
Le protocole d’immuno-analyse EWOD est flexible et peut inclure un certain nombre d’opérations d’unité de laboratoire (p. ex., antigène de capture, mélange, incubation, extraction de perles, lavage) selon le type de réactif, la stabilité et les exigences d’utilisation définies par le protocole d’analyse. Comme preuve de principe, dans l’article actuel, deux protocoles d’immuno-adsay sont envisagés montrant la mise en œuvre de huit ou dix OJO (figure 4) avec la puce EWOD décrite. Une telle miniaturisation mérite à partir du microlitre, des volumes discrets de réactifs / analyte qui augmentent l’efficacité de l’ELISA en réduisant à la fois la consommation de réactifs, le temps requis par opération, essentiellement, le temps expérimental total (6 à 10 min). En outre, l’analyse est automatisée avec la manipulation chronométrée des gouttelettes qui diminue les variations et améliore la précision de l’immuno-analyse17. Dans son format actuel, l’expérience implique la manipulation manuelle des gouttelettes au début de chaque analyse, ce qui est un point pour une discussion plus approfondie dans la section suivante.
Une étape critique dans la méthode Actuelle DMF consiste à distribuer les gouttelettes sur la surface de la puce EWOD. Typiquement, une micropipette avec une pointe jetable est utilisée pour mesurer le volume exact et pour le charger. Cependant, il peut devenir difficile d’immobiliser la gouttelette sur la surface hydrophobe de la plaque d’actionnement en raison des interactions entre la gouttelette et la surface chargée de la pointe jetable. En conséquence, la gouttelette peut tirer vers le haut en suivant la surface extérieure de la pointe au lieu de rester sur la plaque. Pour éviter cela, la micropipette doit être maintenue en position verticale, perpendiculaire à la surface de la puce, sans la toucher, puis la gouttelette peut être distribuée sur le tapis de chargement en le mettant en contact avec la surface. Si la gouttelette colle à la pointe de la pipette, retournez-la à la solution de stock, échangez la pointe et redéposez une gouttelette fraîche. Dans le développement du système actuel de preuve de concept, la livraison automatique des gouttelettes peut être envisagée.
Une autre étape critique, avant d’exécuter l’analyse, est de fermer le couvercle de l’assemblage de plaque parallèle. Comme indiqué précédemment dans le protocole, le couvercle doit être glissé sur la plaque d’actionnement. La surface hydrophobe du couvercle empêche la distorsion et le déplacement des gouttelettes assises sur la plaque d’actionnement. Pour garantir le mouvement en douceur de la gouttelette, il est fortement recommandé d’utiliser une plaque d’actionnement vierge, un chargement correct des gouttelettes et l’assemblage des copeaux. La réutilisabilité des plaques d’actionnement est possible; cependant, le nombre de cycles dépend des tensions d’actionnement (figure 3) et du dépôt d’analyte/réactif sur la surface, aka biofouling. La plate-forme présentée a utilisé la puce EWOD imprimée chrome, qui pourrait être réutilisée de façon fiable pour des mesures consécutives jusqu’à quatre fois à la tension de fonctionnement de 120 V et le nettoyage des plaques intermédiaires après chaque expérience. Les plaques ont été recyclées, afin de réduire le coût par expérience, en décontalant (en brossant la surface avec un agent nettoyant non dilué avant de les rincer complètement) les fluoropolymères amorphes bioendus(Tableau des matériaux)enduit et enrobant un nouveau sur le dessus de la plaque. Cependant, le recyclage des plaques d’actionnement nécessite une manipulation manuelle, des réactifs coûteux (fluoropolymères amorphes(tableau des matériaux))et de l’équipement spécialisé (spin-coater). Les puces EWOD alternatives sont étudiées avec succès avec des substrats rentables tels que le papier19, les films en acétate ou les circuits imprimés (PCB)20,21. Ces consommables jetables peuvent faciliter l’utilisation fiable et abordable de la plate-forme DMF et peuvent fournir des moyens d’éviter la question du biofouling.
Le biofouling est la principale limitation de l’EWOD pour les applications biologiques22,23. Des études antérieures sur le DMF ont identifié deux mécanismes qui contribuent à la biofouling, à savoir, l’adsorption passive due aux interactions hydrophobes, et une adsorption électrostatiquement entraînée se manifestant quand un champ électrique est appliqué24. Les résultats dans l’article courant sont compatibles avec cette théorie car il a été documenté la réutilisabilité de plaque d’actionnement diminue aux tensions élevées d’actionnement. Une explication possible est que les protéines adsorb facilement sur Fluoropolymer-coated (Teflon-like) surfaces et ils agrégent plus rapidement sur les surfaces encrassées par rapport aux surfaces vierges24. En conséquence, les essais liés aux protéines sur DMF sont difficiles à quantifier et peuvent éprouver la perte de l’analyte, la contamination croisée et la précision diminuée17. Le pire scénario est quand une quantité critique d’adsorbs de protéine rendant ainsi l’appareil inutile. Pour minimiser le biofouling, diverses approches ont été étudiées de minimiser le temps de résidence de la gouttelette sur la puce, à travers les revêtements23, aux additifs (c.-à-d., surfactants ou acide pluronique) dans les gouttelettes chargées de biomatériaux6,22. Par conséquent, un aspect important de l’analyse d’immuno-analyse sur EWOD est de choisir des stratégies anti-biofouling qui sont compatibles avec le protocole spécifique à portée de main.
La plate-forme DMF automatisée est conçue pour effectuer un seul test ELISA sandwich par course tout en utilisant des volumes de microlitres pour les réactifs et l’analyte. Lorsqu’il est nécessaire, il existe des kits ELISA conventionnels en sandwich basés sur des plaques pré-enduites de 96 ou 384 puits qui, en combinaison avec l’équipement de laboratoire auxiliaire, entraînent un débit par course plus élevé; sur la base du prix des réactifs seulement, le coût approximatif par analyse/puits est de 6,04 USD (580 USD/96) et de 0,33 USD (2-580 USD/384) respectivement. Cela rend les méthodes ELISA conventionnelles idéales pour un grand nombre d’échantillons traités généralement par du personnel technique qualifié dans des laboratoires centralisés. Toutefois, dans les endroits éloignés, l’analyse détaillée des coûts de l’ELISA pour la surveillance de l’environnement a montré que lorsque les coûts d’immobilisations (c.-à-d. les coûts d’exploitation en laboratoire, les coûts récurrents, le transport d’échantillons, les fournitures et le personnel) étaient inclus, le prix réel par ELISA était de 60 USD, dont 34 USD pour les fournitures par échantillon25. En revanche, la plate-forme DMF proposée est portable, nécessite une formation minimale pour fonctionner et avec des perles pré-enduites peut fournir l’analyse échantillon-réponse en quelques minutes. Par conséquent, la technologie présentée peut être déployée dans des endroits au point de besoin et compléter les analyses autrement disponibles dans les laboratoires centralisés.
Dans la section des résultats représentatifs, la plate-forme automatisée d’immuno-analyse DMF a été utilisée pour la détection directe d’agents pathogènes pour l’application de la défense. D’autres applications possibles pour la plate-forme DMF englobent, mais ne se limitent pas, biodiagnostic, surveillance continue et échantillonnage automatisé. Potentiellement, le DMF pourrait avoir un impact sur divers secteurs, du point de service pour des soins de santé personnalisés, ainsi que la surveillance contrôlée de l’environnement pour la protection des patients contre l’infection acquéreurdale aéroportée des hôpitaux, au système de surveillance des cultures pour l’agriculture et production alimentaire.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à souligner la contribution de nos collègues du Groupe de recherche en microfluidique et microingénierie pour leurs travaux sur la conception mécanique et l’intégration du système. Les auteurs tient à remercier Dstl Porton Down pour leur soutien inestimable et leur contribution financière, aux projets passés et en cours qui développent davantage la technologie DMF et ses applications.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |