쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정
Summary
높은 척수액 단백질 수준은 변경된 혈액 뇌 장벽 또는 신분 합성을 통해 혈장 단백질의 확산의 결과일 수 있습니다. 최적화된 테스트 프로토콜은 두 경우를 모두 구별하는 데 도움이 되며 합성된 단백질의 정량적 측정을 제공하는 이 문서에 제시되어 있습니다.
Abstract
뇌척수액(CSF)은 뇌와 척수에서 발견되는 유체로서 기초 과학과 임상 과학 모두에 매우 중요합니다. CSF 단백질 조성물의 분석은 신경 질환뿐만 아니라 기초 신경 과학 연구에서 중요한 정보를 제공합니다. 한 가지 주의해야 할 점은 CSF에서 측정된 단백질은 혈청에서 의한 경막 합성 및 과장 둘 다에서 파생될 수 있으며, CSF의 단백질 분석은 이 두 성분의 합만을 결정할 수 있다는 것입니다. 인간뿐만 아니라 동물 모델에서 단백질 과 단백질 을 생산한 단백질을 구별하기 위해, CSF 단백질 프로파일링 측정은 기존의 단백질 분석 도구를 사용하여 알부민 CSF/혈청 지수(Q알부민),혈액-뇌 인터페이스(BBI) 및 단백질 지수(Q 단백질/Q알부민)의 무결성의 마커인 단백질 의 계산을 포함해야 한다. 이 프로토콜은 CSF 및 혈액 수집에서 지수 및 지수 계산에 이르기까지 신경 장애의 마우스 모델에서 의 단백질 합성 및 BBI 손상의 정량적 측정에 대한 전체 절차를 보여줍니다.
Introduction
뇌척수액(CSF)은 뇌와 척수를 둘러싼 맑고 무색의 액체로 임상적이고 기본적인 과학적 중요성을 지니고 있습니다. CSF는 중추 신경계 (CNS)의 전해 환경을 보존하고, 전신 산 염기 상태의 균형을 맞추고, 신경 세포 및 신경 교세포 세포에 영양분을 공급하고, CNS를 위한 림프계로서의 기능을 공급하고, 호르몬, 신경 전달 물질, 사이토카인 및 기타 신경 펩타이드를 CNS1전반에 걸쳐 수송합니다. 따라서, CSF 조성물은 CNS의 활성을 반영함에 따라, 이 유체는 CNS의 생리적 및 병리학적 상태를 특성화하기 위해 간접적이지만 귀중한 접근을 제공한다.
CSF는 백 년 이상 동안 CNS에 영향을 미치는 조건을 진단하기 위하여 이용되었습니다, 그리고 이 시간의 대부분을 위해, 진단 공구로 임상의에 의해 1 차적으로 공부되었습니다. 그러나, 최근 몇 년 동안 신경 생물학자는 CNS의 병리생리학을 공부하기위한 CSF의 잠재력을 인식했습니다. 특히, 신경과학 분야에서 는 여러 고처리량 단백질 분석 도구가 도입되어 CSF의 단백질 조성에 대한 상세한 연구를 가능하게 되었으며, 이러한 분석이 동적 변화에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수 있다는 기대를 가지고 있습니다. CNS 내에서 발생합니다.
Luminex 및 Simoa 기술2,3과같은 멀티플렉스 면역 분석 기술의 기술 개발은 오늘날 연구원들에게 매우 낮은 농도에서 수백 개의 단백질을 검출 할 수있는 능력을 제공합니다. 더욱이, 이러한 기술은 작은 샘플 부피를 사용하여, 따라서 CSF의 제한된 샘플 볼륨이 최근까지 유체의 상세한 특성화를 배제한 마우스를 포함한 작은 동물에 대한 연구를 촉진합니다.
그럼에도 불구 하 고, 한 가지 주의할 점은 CSF에서 측정 된 단백질 손상 된 혈액-뇌 인터페이스 (BBI)로 인해 혈 청에서 경막 합성 및/또는 transudation에서 파생 될 수 있습니다. 불행히도, CSF의 단백질 분석만으로는 이 두 성분의 합만을 결정할 수 있다. 트랜스페더와 신경계 생산 단백질을 구별하기 위해 사용 가능한 단백질 분석 도구를 사용하는 CSF 단백질 측정은 혈청 농도의 개별 적인 가변성과 장벽 무결성에 맞게 조정되어야 합니다. 그러나, 이러한 조정은 임상 실습에서 일반적으로 사용되지만, 예를 들어, CSF IgG 지수는 경막 내 IgG 합성4,5,6을검출하기 위한 높은 민감도를 가지며, 현재까지 극소수의 연구 연구가 혈청 농도 및 장벽 무결성에 대한 CSF 단백질 농도를 보정한7,8.
현재, Reibergram 접근은 단백질의 장벽 기능 그리고 intrathecal 합성을 결정하는 가장 좋은 방법입니다. 이는 CSF/혈청 지수 다이어그램에서 그래픽 평가로서, 통합된 방식으로, 장벽(dys) 기능 과 경내 단백질 합성을 모두 분석하며, 독점적으로 혈액 유래 단백질9,10을지칭한다. 고농축 단백질 알부민은 일반적으로 간에서만 생산되기 때문에 기준 단백질로 선택되며 그 크기는 약 70 kDa이며, 작고 큰 단백질11사이의 중간기이기 때문이다. 분석 도면은 1987년 라이버와 펠겐하우어에 의해 처음 정의된 면역글로불린(Igs)11의주요 클래스에 대해, 수천 개의 인간 샘플의 분석으로부터 얻은 결과에 기초하여 경험적으로9. 이 접근법은 분자확산/유량(12)의이론에서 두 픽의 확산 법칙의 적용에 의해 이후에 확인되었다. 이러한 이론은 장벽을 통한 단백질의 확산을 입증하고 과장분포를 가지며 CNS9,13에서단백질의 역학을 정량적으로 설명할 수 있다. 전반적으로, 경막 내 단백질 합성을 입증하기 위한 Reibergram을 사용하는 이점은 혈청에서 CSF에 들어가는 단백질 분획뿐만 아니라 국소 생산으로 인해 CSF에서 발견되는 단백질의 양을 동시에 식별한다는 것입니다.
본 기사 및 관련 프로토콜은 CSF 및 혈액 채취에서 부터 CSF 단백질 수준을 교정하는 최종 계산에 이르기까지, 신경학상 마우스 모델에서 의학적 단백질 합성의 정량적 측정에 대한 전체 절차를 설명합니다. 장애. 이 절차는 (1) 임의의 CSF 단백질의 병리생리학적 기원및 (2) 장벽 무결성의 안정성 및 기능적 중요성을 평가하는 기준을 제공한다. 이 절차 및 프로토콜은 마우스 CSF 샘플을 평가하는 데 유용할 뿐만 아니라 신경 질환 및 인간 환자의 다양한 동물 모델에서 CSF를 분석하는 데에도 유용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
증가된 CSF 단백질 농도의 평가를 위한 정량적 방법은 CNS의 생리적 및 병리학적 상태의 특성화에 유용한 도구이다. 그러나, CSF 단백질 수준의 신뢰할 수 있는 정량화를 넘어, CSF 단백질의 검출은 CSF에서 혈액과 CNS 유래 분획을 구별하는 결과의 발현을 필요로 한다. 그러나, 현재까지, 일반적으로 사용되는 단백질 정량 화 분석제는 높은 처리량 공구의 도움으로조차, 2개의 단백질 분대 사이 차별을 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 비교 의학 및 연구 센터의 직원에게 감사 (CCMR) 이러한 연구에 사용되는 마우스의 그들의 전문가 치료에 대한 다트머스에서. 보른스타인 연구 기금은 이 연구에 자금을 지원했습니다.
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
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