מדידה כמותית של מתוך מסונתז חלבונים בעכברים
Summary
רמת החלבון של נוזל השדרה הגבוה יכול להיות תוצאה של דיפוזיה של חלבון פלזמה על פני מחסום דם-מוח שונה או סינתזה התוך. פרוטוקול בדיקה מיטבי מוצג במאמר זה, המסייע להפלות את שני המקרים ומספק מדידות כמותית של חלבונים מסונתז באופן פנימי.
Abstract
נוזל מוחי שדרתי, נוזל שנמצא במוח ואת חוט השדרה, הוא בעל חשיבות רבה למדע בסיסי וקליני. ניתוח הרכב חלבון שדרתי מספק מידע חיוני במחקר בסיסי במדעי המוח, כמו גם מחלות נוירולוגיות. אזהרה אחת היא כי חלבונים הנמדדים בתוך שדרתי עשוי לנבוע הן סינתזה הפנימי והטראנזפה מן הנסיוב, וניתוח חלבונים של שדרתי יכול רק לקבוע את הסכום של שני רכיבים אלה. על מנת להפלות בין החלבון המופק מהדם לבין החלבונים המיוצרים בדגמי בעלי חיים, כמו גם בבני אדם, מדידות חלבון שדרתי פרופיל באמצעות כלים קונבנציונליים ניתוח חלבון חייב לכלול את החישוב של המנה האלקטרוליציונלית/סרום (Qאלבומין), סמן של השלמות של הממשק בדם-מוח (bbi), ואת מדד החלבון (Qחלבון/qאלבומין), הערכה של סינתזה החלבון הפנימי. פרוטוקול זה ממחיש את ההליך כולו, מ שדרתי ואיסוף דם לחישובי quotients ואינדקסים, עבור המדידה הכמותית של סינתזה החלבון הפנימי וליקוי BBI בדגמי העכבר של הפרעות נוירולוגיות.
Introduction
נוזל מוחי שדרתי, נוזל ברור וחסר צבע סביב המוח וחוט השדרה, מחזיק בחשיבות מדעית קלינית ובסיסית גדולה. המוח השדרתי משמר את הסביבה האלקטרוטית של מערכת העצבים המרכזית (CN), מאזנת את הסטטוס בסיס חומצה מערכתית, אספקת חומרים מזינים לתאי העצבי והגליאל, פונקציות כמו מערכת הלימפה עבור ה-CN, ו הובלות הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, ציטוקינים ונוירופפטידים אחרים ברחבי ה-CN1 לפיכך, כאשר הרכב הנוזל הנוזלי משקף את הפעילות של ה-CN, החומר הזה מציע מגוון בעל ערך, אם כי עקיף, גישה לאפיון המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של ה-CN.
שדרתי שימוש כדי לאבחן את התנאים המשפיעים על ה-CN למעלה ממאה שנים, ובמשך רוב הזמן הזה, הוא למד בעיקר על ידי מטפלים ככלי אבחון. עם זאת, בשנים האחרונות נוירוביולוגים הכירו את הפוטנציאל של שדרתי לחקר הפתופסולוגיה של ה-CN. בפרט, מספר כלי ניתוח חלבון בתפוקה גבוהה הוצגו בתחום מדעי המוח המאפשר מחקר מפורט של הרכב החלבון של שדרתי, עם הציפייה כי ניתוח זה עשוי לעזור לספק תובנה שינויים דינמיים תרחשות בתוך ה-CN.
התפתחויות טכנולוגיות בשיטות חיסוני מולטיפלקס כגון לומיקס וסימוע טכנולוגיות2,3, לספק לחוקרים היום עם היכולת לזהות מאות חלבונים בריכוזים נמוכים מאוד. כמו-כן, אותן טכנולוגיות מאפשרות שימוש באמצעי אחסון קטנים לדוגמה, ובכך לקדם מחקרים בבעלי חיים קטנים, כולל עכברים, בהם כמויות מוגבלות של מדגם שדרתי מנעה באופן מוגבל תווים מפורטים של הנוזל עד לאחרונה.
אף על פי כן, אזהרה אחת היא כי חלבונים הנמדדים בתוך שדרתי עשוי לנבוע סינתזה הפנימי ו/או ההמרה מן הנסיוב בשל ממשק דם פגום מוח (BBI). למרבה הצער, ניתוח חלבונים של שדרתי בלבד יכול רק לקבוע את הסכום של שני רכיבים אלה. כדי להפלות בין transudate ובין הייצור חלבונים, מדידות חלבון שדרתי באמצעות כל הכלי הזמין ניתוח חלבון חייב להיות מותאם לשונות בודדות ריכוזי סרום, כמו גם שלמות המכשול. עם זאת, למרות התאמה זו משמשת בדרך כלל בפרקטיקה קלינית, למשל, המדד igg שדרתי, אשר יש רגישות גבוהה לזיהוי הפנימי סינתזה igg4,5,6, עד תאריך מחקרים מעטים מאוד מתוקן ריכוזי חלבון שדרתי לריכוז סרום ושלמות המכשול7,8.
כיום, הגישה הרייברגרמה היא הדרך הטובה ביותר לקבוע את תפקוד המכשול וסינתזה של חלבונים. זהו הערכה גרפית בדיאגרמות שדרתי/סרום מנה אשר מנתחת, באופן משולב, הן המכשול (dys) פונקציה סינתזה חלבון הפנימי, המתייחס חלבון בלעדי דם נגזר9,10. אלבומין החלבון העשיר ביותר נבחר בדרך כלל חלבון התייחסות כי הוא מיוצר רק בכבד ובגלל גודלו, כ 70 kDa, הוא ביניים בין חלבונים קטנים וגדולים11. דיאגרמת הניתוח הוגדרה לראשונה על ידי “רייבר ופלינהאואר” ב-1987 לכיתות הגדולות של האימונוגלובונים11, המבוססות על התוצאות שהתקבלו מניתוח של אלפי דגימות אדם9. הגישה אושרה לאחר מכן על ידי יישום שני חוקי הדיפוזיה של Fick בתאוריה של דיפוזיה מולקולרית/שיעור זרימה12. תיאוריה מעין זו ממחישה את הדיפוזיה של חלבון דרך המכשול יש התפלגות היפרבולי יכול להסביר את הדינמיקה של חלבונים ב-cn9,13. בסך הכל, היתרון של שימוש ברייברגרמה לצורך הוכחת סינתזה החלבון הפנימי הוא שהוא במקביל מזהה את שבר החלבון הנכנס השדרתי מן הנסיוב, כמו גם את כמות החלבון שנמצא השדרתי בגלל הייצור המקומי.
המאמר הנוכחי והפרוטוקול הקשור מתארים את ההליך כולו, מתוך מתקן שדרתי ואיסוף דם לחישובים הסופיים לתיקון שדרתי את רמות החלבון, עבור המדידה הכמותית של סינתזת החלבון הפנימי במודלים של העכבר הנוירולוגי פרעות. הליך זה מספק תוכנית בסיסית שממנה יש להעריך (1) את המקור הפתופסולוגי של חלבון שדרתי כלשהו ו-(2) את היציבות והמשמעות הפונקציונלית של שלמות המכשול. הליך זה ופרוטוקול אינם שימושיים רק להערכת דגימות של העכבר, אבל הם גם שימושיים בניתוח שדרתי בהמון מודלים בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות וחולים אנושיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות כמותיים להערכת ריכוזי חלבון שדרתי מוגברת הם כלים שימושיים באפיון המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של ה-CN. עם זאת, מעבר לקוונפיקציה אמין של רמות חלבון שדרתי, הזיהוי של חלבונים מתוך שדרתי מחייב ביטוי של תוצאות המפלה בין שברים דם ומערכת התחתית של שדרתי. עם זאת, עד כה, כימות החלבון הנפוץ בשימוש ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לצוות המרכז לרפואה השוואתית ומחקר (CCMR) ב דארטמאות עבור הטיפול המומחים שלהם העכברים המשמשים למחקרים אלה. קופת המחקר של בורנשטיין מימנה את המחקר הזה.
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
- Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
- Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
- Reiber, H. Cerebrospinal fluid–physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
- DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler’s virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
- Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)–a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
- Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid – The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
- Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
- Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
- Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
- Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult – E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
- McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler’s virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
- Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
- Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
- Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
- Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
- Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
- Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
- Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler’s virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
- Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
- Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
- Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
- Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
- Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).
