Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi
Summary
Livelli elevati di proteine del fluido spinale possono essere il risultato della diffusione della proteina plasmatica attraverso una barriera emato-encefalica alterata o sintesi intratea. In questo articolo viene presentato un protocollo di test ottimizzato che aiuta a discriminare entrambi i casi e fornisce misurazioni quantitative delle proteine sintetizzate intrathecally.
Abstract
Il liquido cerebrospinale (CSF), un fluido trovato nel cervello e nel midollo spinale, è di grande importanza sia per la scienza di base che clinica. L’analisi della composizione delle proteine CSF fornisce informazioni cruciali nella ricerca sulle neuroscienze di base e sulle malattie neurologiche. Un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare sia dalla sintesi intrateca che dalla trasposizione dal siero, e l’analisi delle proteine del CSF può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra la trasposizione proteica dal sangue e le proteine prodotte intratelamente nei modelli animali e negli esseri umani, le misurazioni di profilazione delle proteine CSF utilizzando strumenti di analisi delle proteine convenzionali devono includere il calcolo dell’albumina CSF/serum quotient (Qalbumin),un marcatore dell’integrità dell’interfaccia emato-encefalica (BBI), e l’indice proteico(proteinaQ /Qalbumin ), una stima della sintesi di proteine intrateche. Questo protocollo illustra l’intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli dei quozienti e degli indici, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche e la compromissione della BBI nei modelli murini di disturbi neurologici.
Introduction
Il liquido cerebrospinale (CSF), un liquido chiaro e incolore che circonda il cervello e il midollo spinale, ha una grande importanza clinica e scientifica di base. Il CSF conserva l’ambiente elettrolitico del sistema nervoso centrale (CNS), bilancia lo stato di base dell’acido sistemico, fornisce nutrienti alle cellule neuronali e gliali, funziona come sistema linfatico per il SNC e trasporta ormoni, neurotrasmettitori, citochine e altri neuropepti in tutto il CNS1. Così, poiché la composizione csF riflette l’attività del SNC, questo fluido offre un prezioso, anche se indiretto, accesso per caratterizzare lo stato fisiologico e patologico del SNC.
CSF è stato utilizzato per diagnosticare condizioni che colpiscono il SNC per oltre un centinaio di anni, e per la maggior parte di questo tempo, è stato studiato principalmente dai medici come strumento diagnostico. Tuttavia, negli ultimi anni i neurobiologi hanno riconosciuto il potenziale della CSF per studiare la fisiopatologia del SNC. In particolare, nel regno delle neuroscienze sono stati introdotti diversi strumenti di analisi delle proteine ad alto contenuto di velocità, consentendo uno studio dettagliato della composizione delle proteine del CSF, con l’aspettativa che questa analisi possa contribuire a fornire informazioni sui cambiamenti dinamici all’interno del SNC.
Gli sviluppi tecnologici nelle tecniche di immunoanalisi multiplex come le tecnologie Luminex e Simoa2,3, forniscono ai ricercatori oggi la capacità di rilevare centinaia di proteine a concentrazioni molto basse. Inoltre, queste stesse tecnologie consentono l’uso di piccoli volumi di campioni, promuovendo così studi su piccoli animali, compresi i topi, in cui volumi di campioni limitati di CSF hanno impedito caratterizzazioni dettagliate del fluido fino a poco tempo fa.
Tuttavia, un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare da sintesi intrateca e/o trasuda dal siero a causa di un’interfaccia emato-encefalica danneggiata (BBI). Sfortunatamente, l’analisi delle proteine del CSF da sola può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra proteine prodotte innodate e intratelamente, le misurazioni delle proteine CSF utilizzando qualsiasi strumento di analisi delle proteine disponibile devono essere regolate per la variabilità individuale nelle concentrazioni di siero e l’integrità delle barriere. Tuttavia, anche se questa regolazione è comunemente utilizzata nella pratica clinica, ad esempio, l’indice CSF IgG, che ha un’elevata sensibilità per rilevare la sintesi intrateca IgG4,5,6, ad oggi pochissimi studi di ricerca hanno corretto le concentrazioni di proteine CSF per la concentrazione di siero e l’integrità della barriera7,8.
Attualmente, l’approccio Reibergram è il modo migliore per determinare la funzione di barriera e la sintesi intratecala delle proteine. Si tratta di una valutazione grafica nei diagrammi quoziente CSF/siero che analizza, in modo integrato, sia la barriera (di)funzione che la sintesi delle proteine intrateche, riferendosi a una proteina esclusivamente derivata dal sangue9,10. L’abbondante albumina proteica è solitamente scelta come proteina di riferimento perché è prodotta solo nel fegato e perché la sua dimensione, circa 70 kDa, è intermedia tra proteine piccole e grandi11. Il diagramma di analisi è stato definito per la prima volta da Reiber e Felgenhauer nel 1987 per le principali classi di immunoglobuine (Igs)11, essendo empiricamente basate sui risultati ottenuti dall’analisi di migliaia di campioni umani9. L’approccio è stato successivamente confermato dall’applicazione delle due leggi di diffusione dei due Fick nella teoria della diffusione molecolare/velocità di flusso12. Tale teoria dimostra la diffusione di una proteina attraverso la barriera ha una distribuzione iperbolica e può spiegare quantitativamente la dinamica delle proteine nel CNS9,13. Nel complesso, il vantaggio di utilizzare il Reibergram per dimostrare la sintesi delle proteine intratecali è che identifica contemporaneamente la frazione proteica che entra nel CSF dal siero e la quantità di proteine presenti nel CSF a causa della produzione locale.
Il presente articolo e il relativo protocollo descrivono l’intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli finali che correggono i livelli di proteine CSF, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche in modelli murini di neurologia Disturbi. Questa procedura fornisce una linea di base rispetto alla quale valutare (1) l’origine patofisiologica di qualsiasi proteina CSF e (2) la stabilità e il significato funzionale dell’integrità della barriera. Questa procedura e questo protocollo non sono solo utili per valutare campioni di CSF dei topi, ma sono anche utili nell’analisi della CSF in una moltitudine di modelli animali di malattie neurologiche e pazienti umani.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi quantitativi per la valutazione delle maggiori concentrazioni di proteine CSF sono strumenti utili per la caratterizzazione dello stato fisiologico e patologico del SNC. Tuttavia, al di là della quantificazione affidabile dei livelli di proteine CSF, il rilevamento delle proteine CSF richiede un’espressione dei risultati che discriminano tra le frazioni derivate dal sangue e il SNC nel CSF. Tuttavia, ad oggi, i saggi di quantificazione delle proteine comunemente utilizzati non consentono la discriminazione tra …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Fondo di Ricerca Bornstein ha finanziato questa ricerca.
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
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