एंटरॉइड में प्रोलिफेरेटिव और डेड सेल्स का परिमाणीकरण
Summary
प्रस्तुत प्रोटोकॉल सुसंस्कृत माउस एंटरॉइड में प्रसार और मृत कोशिकाओं की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। यह विधि ऑर्गेनोइड प्रसार और अस्तित्व पर दवा उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने में सहायक है।
Abstract
आंतों का एपिथेलियम एक बाधा के रूप में कार्य करता है जो शरीर के बाकी हिस्सों में प्रवेश करने से रोगजनक माइक्रोबायोटा और विषाक्त पदार्थों जैसी चमकदार सामग्री को रोकता है। एपिथेलियल बैरियर फ़ंक्शन को आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं की अखंडता की आवश्यकता होती है। जबकि एपिथेलियल सेल प्रसार कोशिकाओं की एक सतत परत रखता है जो एक बाधा बनाता है, एपिथेलियल क्षति बाधा रोग की ओर ले जाती है। नतीजतन, चमकदार सामग्री एक अप्रतिबंधित मार्ग के माध्यम से आंतों की बाधा के पार कर सकते हैं । आंतों की बाधा की शिथिलता कई आंतों की बीमारियों से जुड़ी हुई है, जैसे भड़काऊ आंत्र रोग। अलग-थलग माउस आंतों के तहखाने को क्रिप्ट-विलस जैसी संरचनाओं के रूप में सुसंस्कृत और बनाए रखा जा सकता है, जिन्हें आंतों के ऑर्गेनॉइड या “एंटरॉइड” कहा जाता है। एंटरॉइड विट्रो में आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार और कोशिका मृत्यु का अध्ययन करने के लिए आदर्श हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम सुसंस्कृत आंत्रशोथ में प्रसारात्मक और मृत कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। 5-एथिनिल-2′-डिऑक्सीरिडीन (ईडीयू) और प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग एंटोलाइड में प्रसार और मृत कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाता है, और इसके बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रसार और मृत कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण किया जाता है। यह आंतों के एपिथेलियल सेल प्रसार और सेल अस्तित्व पर दवा उपचार के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
Introduction
आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं का एक मौलिक कार्य रोगजनक बैक्टीरिया और विषाक्त पदार्थों जैसे चमकीली सामग्री के प्रवेश की रक्षा करना है1,2. इस तरह के एक समारोह को करने के लिए, आंतों स्टेम कोशिकाओं लगातार पैदा और आंत्रशोथ कोशिकाओं, enterocytes और गुप्त कोशिकाओं सहित एपिथेलियल कोशिकाओं की एक किस्म में अंतर, जो तंग कनेक्शन3बनाने के द्वारा एक बाधा फार्म । आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं के तेजी से नवीनीकरण के लिए सेल प्रसार, सेल भेदभाव और सेल डेथ4,5के सख्त समन्वय की आवश्यकता होती है। कोशिका प्रसार या अत्यधिक कोशिका मृत्यु कम होने से एपिथेलियल क्षति होती है और बाधा कार्य1,6से समझौता हो जाता है । आंतों की बाधा की शिथिलता भड़काऊ आंत्र रोगों7,8से जुड़ी हुई है ।
आंतों के तहखाने संस्कृति के लिए एक विधि पहले विकसित किया गया है । इस तकनीक का उपयोग करके, अलग-थलग माउस क्रिप्ट्स आंतों के ऑर्गेनॉइड (आंत्रशोथ) में विकसित होते हैं, जिनमें तहखाना-विलस जैसी संरचनाएं होती हैं और इसमें सभी आंतों के एपिथेलियल सेल वंश9,10होते हैं। 5- एथिनिल-2′-डिऑक्सीरिडीन (ईडीयू) एक थाइमिडीन एनालॉग है जो डीएनए में थाइमाइन (टी) को बदलने में सक्षम है जो कोशिका प्रसार के दौरान प्रतिकृति के दौर से गुजर रहा है। प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को ईडू धुंधला द्वारा जल्दी और सटीक रूप से लेबल किया जा सकता है। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) एथिडियम ब्रोमाइड का एक एनालॉग है जो डबल-फंसे डीएनए में सम्मिलन पर लाल फ्लोरेसेंस जारी करता है। पीआई विशेष रूप से मृत कोशिकाओं का पता लगाता है, क्योंकि यह केवल क्षतिग्रस्त कोशिका झिल्ली से गुजरता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम पहले वर्णन करते हैं कि कैसे मूत्र छोटी आंत से तहखाने को अलग किया जाए फिर उन्हें विट्रो में आंत्रशोथ के रूप में संस्कृति। फिर हम ईडू और पीआई निगमन और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एंटरॉइड में प्रसारात्मक और मृत कोशिकाओं का विश्लेषण करने के तरीके का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल में विट्रो में आंत्रशोथ की संस्कृति के लिए आवश्यक कदमों और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एंटरॉइड में एडु और पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं की मात्रा का विवरण दिया गया है। इस रणनीति के कई फायदे हैं। स?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31971062, 31900326, और 31601022), जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (BK20190043, BK20180838), राज्य की दवा जैव प्रौद्योगिकी की राज्य कुंजी प्रयोगशाला के अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित है, नानजिंग विश्वविद्यालय (केएफ-जीएन-202004)। चीन के जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों की प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (19KJB320003), सूज़ौ शहर के आजीविका और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (SYS2019030), और जियांग्सू प्रांत के कॉलेज स्नातकों के लिए अनुसंधान नवाचार कार्यक्रम (KYCX19-1981) . इस काम को सोओखो विश्वविद्यालय के तांग विद्वान द्वारा भी समर्थित किया जाता है।
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
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