Laser opsamling Microdissection af mus embryonale brusk og knogle for genekspression analyse

Summary

Denne protokol beskriver laser opsamling microdissection til isolering af brusk og knogler fra friske frosne sektioner af muse embryonet. Brusk og knogler kan hurtigt visualiseres ved cresylacetat violet farvning og indsamles netop for at give høj kvalitet RNA for transcriptomic analyse.

Abstract

Laser opsamling microdissection (LCM) er et kraftfuldt værktøj til at isolere specifikke celletyper eller regioner af interesse fra heterogene væv. Den cellulære og molekylære kompleksitet af skelet elementer stiger med udvikling. Vævs heterogenitet, såsom ved grænsefladen af brusk og osseøse elementer med hinanden eller med omgivende væv, er en hindring for studiet af at udvikle brusk og knogler. Vores protokol indeholder en hurtig metode til vævs behandling og isolering af brusk og knogler, der giver høj kvalitet RNA for genekspressions analyse. Friske frosne væv af muse embryoner er sektioneret og korte cresylacetat violet farvning bruges til at visualisere brusk og knogler med farver adskiller sig fra omgivende væv. Glider derefter hurtigt dehydreret, og brusk og knogler er isoleret efterfølgende af LCM. Minimering af eksponering for vandige opløsninger under denne proces bevarer RNA-integriteten. Mus Meckels brusk og mandibulær knogle ved E 16.5 blev indsamlet med succes, og analyse af genekspression viste differens ekspression af markørgener for osteoblaster, osteocytter, osteoklaster og chondrocytter. Høj kvalitet RNA blev også isoleret fra en række væv og embryonale aldre. Denne protokol beskriver prøveforberedelse til LCM, herunder kryoindlejring, skæring, farvning og tørring af fersk frosset væv, og præcis isolering af brusk og knogler med LCM, hvilket resulterer i høj kvalitet RNA til transkriptomic analyse.

Introduction

Bevægeapparatet er et multikomponentsystem bestående af muskler, bindevæv, sener, ligament, brusk, og knogle, innerveret af nerver og vaskulariseret af blodkarrene¹. Skelet vævet udvikler sig med stigende cellulær heterogenitet og strukturel kompleksitet. Brusk og knogle udvikle sig fra den samme osteochondroprogenitorafstamning og er meget beslægtede. Embryonale brusk og knogler udvikler sig i forbindelse med muskler, nerver, blodkar, og udifferentieret mesenchyme. Brusk kan også være omgivet af knogler, såsom Meckels brusk og kondylar brusk i mandibulær knogle. Disse væv er anatomisk forbundet og interagere med hinanden gennem ekstracellulære signaler under udvikling. I studiet af genekspression i udviklingen af brusk og knogler er en forhindring den heterogenitet af skeletstrukturer, der består af flere vævstyper. Præcis isolering af det specifikke væv af interesse er nøglen til en vellykket transkriptional analyse.

Laser opsamling microdissection (LCM) er et kraftfuldt værktøj til at isolere celletyper eller regioner af interesse inden for heterogene væv, og er reproducerbar og er følsom over for enkelt celleniveau². Det kan præcist målrette og fange celler af interesse for en bred vifte af downstream-analyser i transkriptomics, Genomics, og proteomics^3,4. Kvaliteten af det isolerede RNA, DNA eller protein kan vurderes med en bioanalysator eller en tilsvarende platform. For eksempel er RNA-kvalitet indikeret med RNA-integritets nummeret (RIN)⁵.

Her giver vi en protokol til hurtig farvning og isolering af brusk og knogler af LCM fra fersk frosset væv. Vi bruger musen embryo til at påvise, at denne protokol giver høj kvalitet RNA til efterfølgende transcriptomic analyse, såsom RNA sekventering (RNA-SEQ).

Protocol

Væv fra mus blev opnået i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr, og studie protokoller blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg på Icahn School of Medicine på Mount Sinai. 1. tilberedning af frisk frosset prøve Dissekere embryo eller væv af interesse. Integrer prøven i en engangs indlejring skimmel med optimal skære temperatur (OCT) sammensatte. Justér objekternes retning med et tip eller en nål. …

Representative Results

Coronal sektioner af fersk frosset mus væv på e 16.5 blev brugt til at påvise isolation og opsamling af Meckel brusk (MC), kondulær brusk, og mandibulær knogle af LCM. Mus embryoner på E 16.5 blev dissekeret og indlejret i kryogene forme med OCT sammensatte. Prøver i forme blev hurtigt frosset i en tøris og methyl-2-butan bad og opbevares ved-80 °C. For at påvise cresylacetat violet farvning af brusk og knogler, blev cryosectioning i det koronale plan udført og prøver blev indsamle…

Discussion

LCM gør det muligt at isolere beriget eller homogen cellepopulationer fra heterogene væv. Dens fordele omfatter hurtig og præcis opsamling af celler i deres in vivo kontekst, mens potentielle ulemper omfatter det at være tidskrævende, dyrt, og begrænset af behovet for brugeren at genkende særskilte delpopulationer inden for en bestemt prøve³⁰. Denne protokol indeholder oplysninger om LCM af mus embryonale brusk og knogler, fremhæver brugen af cresylacetat violet farvning i en hur…

Materials

2-Methylbutane	ThermoFisher Scientific	O3551-4
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
Centrifuge tube	ThermoFisher Scientific	339653	Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S
Delicate task wiper	ThermoFisher Scientific	06-666
Disposable embedding mold	ThermoFisher Scientific	1220
Distilled water	Invitrogen	10977-015	DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof)	ThermoFisher Scientific	BP2818	Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide	Leica Microsystems	11505158
LCM system	Leica Microsystems	Leica LMD6500
Microscope cover glass	ThermoFisher Scientific	12-545FP
Microscope slides	ThermoFisher Scientific	12-550-15
OCT compound	Electron Microscopy Sciences	102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL	Axygen	PCR-05-C	LCM collection tubes
Permanent mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
RNA isolation kit	ThermoFisher Scientific	KIT0204
RNase decontamination agent	Sigma-Aldrich	R2020	RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene	Sigma-Aldrich	214736